傳代培養(yǎng)的方法及其注意事項

原理
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
材料和試劑
1. 細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株
2. 試劑：0.25％胰酶、1640培養(yǎng)基（含10％小牛血清）
3. 儀器和器材：倒置顯微鏡、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等
操作步驟
1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2. 向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。
3. 置溫箱中2~5分鐘，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化。
4. 吸除消化液，向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細(xì)胞時，動作要輕，以免把已松動的細(xì)胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。
5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。
6. 計數(shù)板計數(shù)后，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。
無菌操作注意事項 
1. 操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
3. 操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。
5. 瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。
6. 吸溶液的吸管等不能混用。                                

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