在藥物研發(fā)和生命科學(xué)研究中，蛋白激酶作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心調(diào)控元件，在多種病理生理過程中扮演關(guān)鍵角色。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人類基因組編碼的518種蛋白激酶中，約有30%與腫瘤、自身免疫病和代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前，全球激酶抑制劑市場(chǎng)規(guī)模已突破750億美元，并保持10%以上的年增長率，成為腫瘤和自身免疫疾病治療的核心領(lǐng)域。

激酶異常活化的病理機(jī)制

01信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)

正常生理狀態(tài)下，激酶通過精確的磷酸化調(diào)控維持細(xì)胞功能平衡。而在疾病狀態(tài)下，激酶活性異常（過度活化或抑制不足）會(huì)導(dǎo)致下游信號(hào)通路紊亂，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)或代謝異常等病理過程。

02多通路交叉調(diào)控

激酶網(wǎng)絡(luò)具有高度的復(fù)雜性和冗余性，常形成正反饋循環(huán)和代償機(jī)制。例如：

• MAPK通路異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展

• JAK-STAT通路過度活化與自身免疫病

• PI3K-AKT-mTOR通路失調(diào)與代謝性疾病

典型激酶相關(guān)疾病及治療靶點(diǎn)

Revvity激酶研究解決方案

傳統(tǒng)激酶活性檢測(cè)方法（放射性檢測(cè)、ELISA等）存在操作繁瑣、通量受限等問題，而ADP-Glo方法需要自行尋找活性底物，且是間接檢測(cè)酶活。Revvity基于HTRF/LANCE均相檢測(cè)平臺(tái)，提供激酶研究解決方案，可為研究者提供高效、快速的激酶抑制劑篩選方法。

01Kinase活性檢測(cè)試劑盒

適用于功能性激酶抑制的篩選，通過直接檢測(cè)底物磷酸化水平的變化，定量分析化合物對(duì)激酶催化活性的抑制能力。

02Kinase結(jié)合檢測(cè)試劑盒

適用于激酶結(jié)合劑的篩選，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)化合物與激酶活性位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)的親和力。

Kinase檢測(cè)技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：

• 高靈敏度：可檢測(cè)pM級(jí)激酶活性變化

• 生理相關(guān)性：保持天然構(gòu)象的激酶-底物相互作用

• 高通量：適合大規(guī)模化合物篩選，檢測(cè)僅需2小時(shí)

• 高兼容性：試劑盒配備的通用型底物兼容200+激酶

HTRF技術(shù)原理與應(yīng)用實(shí)例

KinEASE活性檢測(cè)試劑盒

檢測(cè)原理

KinEASE激酶活性檢測(cè)試劑盒基于均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(HTRF)技術(shù)，采用通用型生物素化絲氨酸/蘇氨酸激酶（STK）或者酪氨酸（TK）底物與鏈霉親和素-XL665（SA-XL665）受體結(jié)合，當(dāng)激酶催化底物磷酸化后，供體銪穴狀化合物（Eu3?-cryptate）標(biāo)記的磷酸化特異性抗體可識(shí)別并結(jié)合磷酸化位點(diǎn)，形成"供體-底物-受體"三元復(fù)合物；在320/340nm激發(fā)光作用下，供體產(chǎn)生的620nm發(fā)射光通過能量轉(zhuǎn)移激發(fā)受體發(fā)出665nm特征信號(hào)，該信號(hào)由酶標(biāo)儀檢測(cè)并定量分析激酶活性。

圖1. HTRF KinEASE活性檢測(cè)原理

操作流程

步驟1：反應(yīng)啟動(dòng)

將待測(cè)化合物（或?qū)φ站彌_液）與激酶、底物混合，加入ATP啟動(dòng)磷酸化反應(yīng)。

步驟2：檢測(cè)體系構(gòu)建

反應(yīng)孵育適當(dāng)時(shí)間后，加入銪（Eu）標(biāo)記的磷酸化抗體及SA-XL665受體，形成檢測(cè)復(fù)合物。

步驟3：信號(hào)檢測(cè)

繼續(xù)孵育1小時(shí)后，使用酶標(biāo)儀讀取信號(hào)（激發(fā)波長320/340 nm，檢測(cè)發(fā)射波長620 nm和665 nm）。

圖2. HTRF KinEASE 活性檢測(cè)步驟

驗(yàn)證數(shù)據(jù)

HTRF KinEASE試劑盒已完成200余種絲氨酸/蘇氨酸激酶及酪氨酸激酶的活性檢測(cè)驗(yàn)證。同時(shí)，我們也提供LANCE® Ultra激酶檢測(cè)平臺(tái)作為選擇

酶濃度梯度滴定曲線與時(shí)間動(dòng)力學(xué)特征

廣譜抑制劑星形孢菌素（Staurosporine）劑量依賴性抑制效應(yīng)

激酶結(jié)合檢測(cè)試劑盒

檢測(cè)原理

Revvity KinEASE結(jié)合檢測(cè)試劑盒采用HTRF競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)原理，通過Eu3?-cryptate標(biāo)記的GST/6His/生物素抗體捕獲相應(yīng)標(biāo)記的激酶，當(dāng)激酶與熒光標(biāo)記的ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑示蹤劑（Staurosporine、Dasatinib或Sunitinib）結(jié)合時(shí)，HTRF信號(hào)比（665nm/620nm）隨示蹤劑結(jié)合增加而升高；待測(cè)化合物通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合激酶ATP位點(diǎn)取代熒光示蹤劑，導(dǎo)致FRET信號(hào)減弱，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)激酶抑制劑的快速篩選和親和力評(píng)估。

圖3. HTRF Kinase Binding檢測(cè)原理

操作流程

步驟1：復(fù)合物形成

將Eu3?-cryptate標(biāo)記的抗體（抗GST/6His/生物素）與標(biāo)簽激酶孵育，使其特異性結(jié)合；同時(shí)加入熒光示蹤劑（Staurosporine/Dasatinib/Sunitinib-XL665）和待測(cè)化合物，兩者競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合激酶的結(jié)合位點(diǎn)

步驟2：信號(hào)檢測(cè)

繼續(xù)孵育1小時(shí)后，使用酶標(biāo)儀讀取信號(hào)（激發(fā)波長320/340 nm，檢測(cè)發(fā)射波長620 nm和665 nm）。

圖4. HTRF Kinase Binding檢測(cè)步驟

驗(yàn)證數(shù)據(jù)

d2熒光受體標(biāo)記的紅色示蹤劑示蹤劑滴定曲線

幾種激酶結(jié)合劑的劑量依賴性抑制曲線

產(chǎn)品列表