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荧光分光光度计使用的时候存在两种模式，一种是固定Ex扫Em，一种是固定Em扫Ex，将一个范围的Ex（如230nm~300nm）的ex所对应的Em组合起来就是3D荧光。简单的说，Ex是激发，也就是手电筒（光源），固定Ex的意思就是只用某个波长，如254nm作为光源来激发样品，观察的是固定该光源时，样品在不同波长位置所展现的荧光强度（即em），简单的说，就是看光屏上的强度。这一模式是为了了解待测物在哪个波段有光致发光现象。而Em，也就是被激发的光（就是接收器上接收到的），这是在知道了我的样品在哪一个位置发光（被激发后发光）后，或者说，选定一个我需要的发光位置后，看看哪一个波长的光源对样品激发效果更好。
一个是激发波长，另一个是发射波长。你得到一个新的样品，你不知道它的激发波长，发射波长，那么办呢。在前辈总结下，荧光分光光度计发现样品的发射波长波动小，所以先确定发射波长。没有激发波长激发，发射波长也得不到。一般荧光样品的激发波长在300-410nm之间，你们可以查看同类物质的激发波长是多少，总结一下，在300—410nm中，先确定一个激发波长。在激发波长的激发下，出现荧光强度变化图谱，荧光强度最大的那个点所对应的发射波长，即图的横坐标上的值，为发射波长。以发射波长确定最佳激发波长原则，荧光分光光度计以上面的发射波长为激发波长，再次得到一个光谱图。在光谱图中，同样有一个最大荧光强度，这个强度所对应的发射波长就是你要找的最佳激发波长。所以会有两条图线，就有两个波长。
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