冰冻切片步骤

冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定硬度，然后进行切片的方法，常用于临床快速病理诊断。以下是基于最新信息的冰冻切片实验步骤：

  1.组织取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，以防止组织发生死后变化。

  2.组织速冻：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内，如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，使组织迅速冰结成块。

  3.组织固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10分钟让OCT胶浸透组织。

  4.切片：将冷冻的样品置于含OCT复合物的低温冷箱中，采用标准的冷冻组织切片法。切片时，低温室内温度以-15℃至-20℃为宜，温度过低组织易破碎。

  5.切片后处理：切好室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定5-10分钟，烘箱干燥20分钟。PBS洗5分钟×3次。

  6.染色：进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却?？捎?%H2O2孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

  7.免疫荧光染色：冰冻切片室温晾干15分钟，用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，室温孵育2小时或4℃过夜。第二天回收一抗，切片置于染缸内，PBS洗5分钟×3次，滴加二抗孵育，回收二抗后进行PBS洗，滴加DAPI工作液染核，室温10-20分钟后封片。

  8.切片保存：做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。

在进行冰冻切片实验时，应注意组织的温度平衡、切片机的设置、载玻片的准备以及切片后的固定和染色步骤。这些步骤的优化有助于获得高质量的冰冻切片，从而提高诊断的准确性.