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異丙醇、 正丁醇、異戊醇的定性分析及乙醇、甲醇、正丙醇的定量分析方法
| 血、尿中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇、 正丁醇、異戊醇的定性分析及乙醇、甲醇、正丙醇的定量分析方法 （GA/T105-1995） 1 頂空氣相色譜法 1.1 適用范圍：適用于低級(jí)醇類、醇性飲料中毒或中毒死亡者的血液和尿液中乙醇對(duì)血液、尿液樣品中進(jìn)行乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇、正丁醇、異戊醇的定性分析及乙醇、甲醇、正丙醇的定量分析。 1.2 原理：本法利用醇類的易揮發(fā)性，以叔丁醇為內(nèi)標(biāo)，用頂空氣相色譜火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)與平行操作的醇類標(biāo)準(zhǔn)品比較，以保留時(shí)間定性；用內(nèi)表法以醇類對(duì)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比進(jìn)行定量。 1.3 器材與試劑 氣相色譜儀（配置火焰離子化檢測(cè)器）；樣品瓶（7ml青霉素瓶） 硅橡膠墊；聚四氟乙烯薄膜；鋁帽；密封鉗；注射器（1ml ）； 硫酸銨；甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液；叔丁醇 1.4 操作步驟 1.4.1色譜條件 氣相色譜儀 a） 色譜柱：（1）5%CARBOWAX20M Carbopack（80-120目）2mm×2m玻璃柱 （2）Porapak S（80~100目）2mm×2m玻璃柱 b） 柱溫： 柱（1）程序升溫：始溫70℃，速率5℃/min，終點(diǎn)170℃（5min） 柱（2）程序升溫：始溫100℃，速率15℃/min，終點(diǎn)200℃（10min） c） 檢測(cè)器：火焰離子化檢測(cè)器（FID） d） 檢測(cè)室溫：230℃ e） 汽化室溫：210℃ f） 載氣（N2）：流速20-35ml/min 1.4.2定性分析 1.4.2.1 樣品制備 取待測(cè)全血（或尿液）1ml加入樣品瓶中，加100ul（2mg/ml）叔丁醇內(nèi)標(biāo)液，約1克硫酸銨，瓶口覆蓋氟乙烯薄膜，硅橡膠墊，用密封鉗加封鋁帽，混勻，置60℃水浴中加熱15—20min。 同時(shí)取空白全血（或尿液）兩份，其中一份添加內(nèi)標(biāo)溶液100ul 和乙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液20ul（20ug），按上述程序平行操作以進(jìn)行空白對(duì)照和已知對(duì)照分析。 1.4.2.2進(jìn)樣 用1ml注射器分別吸取檢材、空白對(duì)照和已知對(duì)照瓶?jī)?nèi)液面上的氣體約0.5ml，注入氣相色譜儀中，每個(gè)試樣進(jìn)樣2~3次，并注入醇類標(biāo)準(zhǔn)溶液。 1.4.2.3記錄與計(jì)算 分別記錄各試樣中內(nèi)標(biāo)物，醇類標(biāo)準(zhǔn)品和可疑醇峰的保留時(shí)間，填入GC定性分析結(jié)果中，計(jì)算它們的保留時(shí)間平均值，并以內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間為1，計(jì)算醇的相對(duì)保留時(shí)間值。 1.5 定量分析 1.5.1樣品制備 精密吸取待測(cè)全血（或尿液）0.5ml兩份，分別加入樣品瓶?jī)?nèi)，加100ul（2mg/ml）叔丁醇內(nèi)標(biāo)液，按1.5.2.1密封瓶口后，混勻，置60℃水浴中加熱15—20min。 另取空白全血（或尿液）兩份，根據(jù)檢材中醇含量的多少，添加乙醇（或甲醇、正丙醇）標(biāo)準(zhǔn)使用液20ug—2mg，內(nèi)標(biāo)液100ul（200ug）按上述方法平行操作。 1.5.2檢測(cè) 氣相色譜儀 按1.5項(xiàng)中所述操作進(jìn)行。 1.5.3記錄與計(jì)算 1.5.3.1記錄檢材及空白添加標(biāo)準(zhǔn)品中乙醇（或甲醇、正丙醇）及內(nèi)標(biāo)物峰面積值，填入GC定量分析記錄表中，并算出各檢材乙醇（或甲醇、正丙醇）及內(nèi)標(biāo)物的平均峰面積值。 1.5.3.2計(jì)算相對(duì)校對(duì)因子 1.5.3.3計(jì)算檢材中醇含量W（mg/100ml） 1.5.3.4計(jì)算相對(duì)相差 式中：W1，W2為兩份檢材平行定量測(cè)定的結(jié)果，W為兩份檢材平均值。 1.6 結(jié)果評(píng)價(jià) 1.6.1定性結(jié)果評(píng)價(jià) 1.6.1.1本法血、尿中乙醇、甲醇的zui低檢出限為1ug/ml。正丙醇的zui低檢出限為10 ug/ml。如果添加于空白檢材中20ug乙醇出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰，而檢材未出現(xiàn)相應(yīng)的醇類色譜峰，可以認(rèn)為檢材中不含醇類，陰性結(jié)果可靠。如果添加于空白檢材中20ug乙醇未出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰，而檢材未出現(xiàn)醇類色譜峰，屬操作有誤，陰性結(jié)果不可靠，應(yīng)重新檢驗(yàn)。 1.6.1.2如果空白檢材未見出醇類色譜峰，而檢材有醇類色譜峰時(shí)。說明空白無干擾，陽性結(jié)果可靠，經(jīng)不同的色譜條件，結(jié)果一致時(shí)一般可以認(rèn)定檢材中含有某種醇類物質(zhì)。必要時(shí)，用GC/MS確證。 1.6.2定量分析結(jié)果評(píng)價(jià) 兩份檢材的相對(duì)差若不超過15%時(shí)，結(jié)果按兩份檢材含量的平均值計(jì)算，相對(duì)相差若超過15%，需重新進(jìn)行測(cè)定。 2 直接進(jìn)樣氣相色譜法 2.1原理 氣相色譜儀 本法利用蛋白沉降劑，使蛋白凝固，經(jīng)離心后取含醇類化合物的上清液用氣相色譜火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，與平行操作的醇類標(biāo)準(zhǔn)品比較，以保留時(shí)間或相對(duì)保留時(shí)間定性，用內(nèi)標(biāo)法以醇類內(nèi)標(biāo)物的峰面積比進(jìn)行定量。 2.2試劑與儀器 氣相色譜儀（配置火焰離子化檢測(cè)器）；漩渦振蕩器；離心機(jī)（4000r/min）； 尖底具塞離心管（5ml）；微量進(jìn)樣器 甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液；叔丁醇；6%高氯酸 2.3操作步驟 2.3.1樣品制備 取待測(cè)全血（或尿液）0.5ml于離心管內(nèi)，加50ul（2mg/ml）叔丁醇內(nèi)標(biāo)液，血樣加0.5ml6%高氯酸，用漩渦振蕩器混勻，以3000r/min速度離心。 同時(shí)取空白全血（或尿液）兩份，其中一份添加內(nèi)標(biāo)溶液50ul和乙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液20ul（20ug），按上述程序平行操作以進(jìn)行空白對(duì)照和已知濃度對(duì)照。 2.4檢測(cè) 2.4.1色譜條件 色譜柱：（1）5%CARBOWAX20M Carbopack（80－120目）2mm×2m玻璃柱 （2）Porapak S（80－100目）2mm×2m玻璃柱 柱溫： 柱（1）程序升溫：始溫70℃，速率5℃/min，終點(diǎn)170℃（5min） 柱（2）程序升溫：始溫100℃，速率15℃/min，終點(diǎn)200℃ （10min） 檢測(cè)器：火焰離子化檢測(cè)器（FID） 檢測(cè)室溫：230℃ 汽化室溫：210℃ 載氣（N2）：流速20－35ml/min 燃?xì)猓℉2）和空氣：流速根據(jù)儀器條件選定 2.4.2進(jìn)樣 用10ul微量進(jìn)樣器分別吸取檢材的空白對(duì)照和已知對(duì)照管內(nèi)上清液1ul注入氣相色譜儀中，每個(gè)試樣進(jìn)樣三次，并注入醇類標(biāo)準(zhǔn)溶液。 2.4.3記錄與計(jì)算 記錄檢材及空白添加標(biāo)準(zhǔn)品中乙醇（或甲醇、正丙醇）及內(nèi)標(biāo)物峰面積值，填入GC定量分析記錄表中，并算出各檢材乙醇（或甲醇、正丙醇）及內(nèi)標(biāo)物的平均峰面積值。 2.5定量分析 2.5.1樣品制備 吸取待測(cè)全血（或尿液）0.5ml兩份，分別加入離心管內(nèi)，加50ul叔丁醇內(nèi)標(biāo)液，按2.3.1沉淀蛋白，離心。 同時(shí)取空白全血（或尿液）兩份，根據(jù)檢材中醇含量的多少，添加乙醇（或甲醇、正丙醇）標(biāo)準(zhǔn)使用液20ug－2mg，內(nèi)標(biāo)液50ul（100ug）按上述方法平行操作。 2.5.2檢測(cè) 按2.4項(xiàng)中所述操作進(jìn)行 2.5.3記錄與計(jì)算 按2.4.3 2.6結(jié)果評(píng)價(jià) 2.6.1本法血、尿中乙醇、甲醇的zui低檢出限為10ug/ml。如果添加0.5ml空白檢材中20ug乙醇未出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰，而檢材未出現(xiàn)醇類色譜峰，屬操作有誤，陰性結(jié)果不可靠，應(yīng)重新檢驗(yàn)。 2.6.2如果空白檢材未見出醇類色譜峰，而檢材有醇類色譜峰時(shí)。說明空白無干擾，陽性結(jié)果可靠，經(jīng)不同的色譜條件，結(jié)果一致時(shí)一般可以認(rèn)定檢材中含有某種醇類物質(zhì)。必要時(shí)，用GC/MS確證。氣相色譜儀 |