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紫外分光光度法测定蛋白质含量

一、实验原理

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是民迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）得到广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。根据蛋白质和核酸的吸收高峰不同，并利用这一性质，通过计算可以适当校正核酸的干扰作用。

二、实验用品

(一)器材

    (1) 752紫外分光光度计。

    (2) 移液管。

(3)试管及试管架。  

  （二）试剂

     标准蛋白质溶液：准确称量经微量凯氏定氮法校正标准蛋白质，用重蒸馏水配制成浓度为1mg/ml的溶液。

    (三)材料

         待测蛋白质样品溶液（用重蒸馏水适当稀释）。

三、实验程序

   1.标准法制作标准曲线

    取8支试管，按表1-1分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。

选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm处分别测定各管溶液的OD280值。以蛋白质浓度为横坐标，OD280值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.样品测定

    取适当浓度的待测蛋白质溶液，同样选用光程为1cm的石英比色杯，测定280nm处的光吸收值，并从标准曲线上查出待测定蛋白质的浓度。