引言 ：藍(lán)藻，又名藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌。一般認(rèn)為，藍(lán)藻是地球 上早進(jìn)行光合放氧的生物。藍(lán)藻可以進(jìn)行光合作用，與 高等植物葉綠素具有一定程度上的同源性，加上其研究體 系簡(jiǎn)單，長(zhǎng)期以來一直是研究光合作用的模式生物。除此 之外，藍(lán)藻還可以進(jìn)行固氮作用，將大氣中的氮?dú)饨?jīng)固氮 作用轉(zhuǎn)化為可以利用的氮源，用于提高土壤的肥力。隨著 人們對(duì)于光合作用認(rèn)識(shí)的加深，以及對(duì)自身生活環(huán)境狀況 的重視，加上藍(lán)藻遺傳體系簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)方便 等，相關(guān)方面的研究已經(jīng)引起越來越多的重視，藍(lán)藻已經(jīng) 成為一種重要的生理生化應(yīng)用研究模式生物。由于藍(lán)藻具 有高光效、生長(zhǎng)速度快、遺傳操作體系相對(duì)成熟，適用大 通量的基因工程改造等一系列傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)，因此，如果可以 通過代謝工程改造藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)蔗糖并提供給大腸桿菌等微 生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料，必將加速整個(gè)生物燃料的產(chǎn)業(yè)化 進(jìn)程，具有顯著的意義。我們通過此種方法測(cè)定藍(lán)藻發(fā)酵 液中的一些成分，如蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、葡萄 糖甘油酯、甘露糖、果糖等，有利于了解其基因改造效 果，對(duì)于充分利用藍(lán)藻意義重大。 本實(shí)驗(yàn)采用離子色譜質(zhì)譜聯(lián)法分離測(cè)定7種糖，分離 度好，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，建立了一種有效檢測(cè)藍(lán)藻發(fā) 酵液中游離糖的方法。
測(cè)試條件： 儀器：ICS-4000色譜儀（Thermofisher公司），配四 元梯度泵，AS-AP自動(dòng)進(jìn)樣器, MSQ單四極質(zhì)譜（ESI源） 色譜柱：CarboPac PA 20 保護(hù)柱6.5 µm, 35×0.4 mm，( P/N: 072073) CarboPac PA 20 分離柱6.5 µm, 150×0.4 mm，( P/N: 072072) 柱溫：30℃； 淋洗液：KOH等度淋洗流速：10 µL /min； 定量環(huán)：0.4 µL； 檢測(cè)方式：質(zhì)譜檢測(cè)（正離子模式加鈉峰） 質(zhì)譜條件：柱后加液NaAC (1 mmol/L) : 乙腈(50 :5 0)， 流速20 µL/min
樣品前處理 取發(fā)酵液樣品，于離心機(jī)中離心20分鐘(3000 rpm)， 上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，過RP柱和0.22 µm尼龍濾膜過 濾，取續(xù)濾液直接上機(jī)分析。 結(jié)果和討論 色譜柱的選擇及淋洗液梯度條件優(yōu)化 在常規(guī)離子色譜上CarboPac PA 20的糖柱上采用 NaOH/NaOAc梯度淋洗的方式，能夠?qū)⑸鲜?種糖*分 離，且色譜行為良好，在ICS 4000單泵條件下，也可利 用KOH梯度將上述幾種糖分離，但其分析和平衡時(shí)間較 長(zhǎng)。在質(zhì)譜條件下可利用分子量的不同，選擇不同的離子通道對(duì)7種糖進(jìn)行定性和定量。為了保證色譜峰的分離度 和保留時(shí)間的合理性，我們選擇CarboPac PA 20的糖柱 和KOH等度淋洗的方式。 在上述色譜條件下7種糖的色譜 圖如下圖（圖1. 總離子流圖，圖2. SIM圖）。
線性和靈敏度 將標(biāo)準(zhǔn)品定量混合，并將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋得到一濃度 系列，對(duì)上述系列濃度各測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn) 液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以葡萄糖甘油酯 為例，其在0.02 mg/L 10 mg/L范圍內(nèi)線性良好，其回歸 方程、相關(guān)系數(shù)如表1所示。
結(jié)論： 離子色譜分離脈沖安培檢測(cè)器測(cè)定糖分離度好靈敏度 高，在糖類物質(zhì)的研究中應(yīng)用非常廣泛。毛細(xì)管離子色譜 常用色譜柱直徑為0.4 mm，流速為10 µL/min，其進(jìn)樣體 積通常為0.4 µL，與常規(guī)分析型離子色譜相比，其靈敏度 是常規(guī)離子色譜的近百倍，且。毛細(xì)管離子色譜的流速 是10 µL/min，符合質(zhì)譜對(duì)低流速的需求；且經(jīng)過抑制器 后，淋洗液中的鉀離子被交換到廢液中，進(jìn)入質(zhì)譜的流動(dòng) 相基本為水，與質(zhì)譜具有很好的兼容性，在需要進(jìn)行定性 研究時(shí)可連接質(zhì)譜。并且在進(jìn)入質(zhì)譜前，可以通過一個(gè)三 通引入部分乙腈以增加質(zhì)譜的霧化效率，增加儀器的穩(wěn)定 性。本方法在柱后乙腈溶液中添加了少量乙酸鈉，以提高 糖在質(zhì)譜中的重現(xiàn)性。毛細(xì)管離子色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定糖方 法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，線性范圍內(nèi)相關(guān)性好，準(zhǔn)確度 高，進(jìn)一步拓展了毛細(xì)管離子色譜的應(yīng)用范圍，具有較高 的實(shí)用價(jià)值。
參考文獻(xiàn) [1] Mou S F, Liu K N, Ding X J. Ion Chromatographic Method and Its Appliction. 2nd ed. Beijing: Chemical Industry Press (牟世芬，劉克納，丁曉 靜. 離子色譜方法及應(yīng)用，第2版.北京：化學(xué)工 業(yè)出版社），2005：76，140，154 [2] González-Noriega A, Michalak C, Antonio Sosa Melgarejo J. Biochim. Biophys. Acta, Mol. Cell Res., 2005, 1745( 1): 7 [3] Mou S F, Yu H, Cai Y Q. Chinese Journal of chromatography（牟世芬 于泓 蔡亞岐. 色譜), 2009, 27(5): 667 [4] Fan L, Xu Y, Lian Z N, et al. Chinese Journal of chromatography（范麗，徐勇，連之娜等. 色譜), 2011, 29(1): 75
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
會(huì)員.png)
17
立即詢價(jià)
您提交后，專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)