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产品简介：

本试剂盒是基于沙门氏噬菌体T3 RNA 聚合酶的RNA 体外转录及加帽试剂盒，它利用含有 T3 启动子的模版 DNA，以 NTP 和 m7G(5' )ppp(5' )G 为底物从 T3 启动子下游开始合成与模板 DNA 中一条链互补的 RNA，简单快速获得大量的 RNA 分子（含带帽 RNA）。

产品特点：

1.即开即用，用户只需提供含 T3 启动子的 DNA 模板即可以进行体外转录实验，不需单独准备每一个成份。

2.体外转录和加帽同管一步式进行，不需要先体外转录再加帽。

3.单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。

4.模板 DNA 可以是线性化的质粒 DNA，也可以是 PCR 扩增产物。

5.可以合成的 RNA 的最佳长度在 20nt 到 5000nt 之问。

6.产品配方经过精心优化，每μg DNA 模板可以合成 2-6μg RNA。

7.得到的加帽 RNA 比不加帽的 RNA 更稳定，可以用于 RNA 结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰（RNAi）等实验。

产品参数：

成份规格包装

2×T3 体外转录及加帽预配液50μL0.1mL 本盖管

T3 RNA 聚合酶-RI 混合液5μL10μL 红盖管

RNase-free 水1mL1mL 蓝盖管

使用手册1 份无

保存和运输

T3体外转录及加帽试剂盒低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

如果需要去除转录产物中的 DNA 模板，则需要 RNase-free DNase、Tris 饱和

酚、氯仿、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇。

使用方法：

一、制备 DNA 模板

PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的 DNA 序列的上游必须有 T3 启动子。如果模板是 PCR 产物， 则可以在设计引物时将 T3 启动子序列

（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是将 DNA 片段克隆

到载体上，则需要选择有 T3 启动子的载体，并且克隆位点必须位于 T3 启动子下游。三是需要转录的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果

是 3’突出（如选择了 Pst I 来线性化质粒），则最好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必须保证 DNA 模板中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般要使用大量的 RNase A，因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒 DNA。并且加入少量总 RNA 一起保温，然后电泳检测 RNA 是否被降解，以此判断纯化的DNA 模板是否有残留 RNase A。

二、体外转录及加帽反应

1.如果有 N 个样品，强烈建议做一个阴性对照，故共设置 N+1 个反应，这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板 DNA，哪个条带是扩增得到的RNA。在 N+1 个 RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在 4℃下）按次序加入下列成分：

注：此为 20μL 反应体系的用量，对其他体积的反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记 RNA 探针，则需要另购 NTP 与 2×T3 转录预配液分开提供的试剂盒。

2.37℃保温 1-2 小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。

3.70℃加热 10 分钟灭活 T3 RNA 聚合酶。

4.取 1-3μL 电泳检测转录效果。比阴性对照多出的条带就是扩增得到的 RNA

（由于检测时的电泳不需要碱变性胶，并且合成的 RNA 长度不一定均匀， 即使长度均匀，但由于自生形成发夹结构，因此不一定呈现清晰的电泳条带。但由于 RNA 是单链，分子量比同样长度的 DNA 小一倍，因此转录得到的 RNA 一般比其模板电泳速度更快。

5.定量，可以用自备的单链 RNA 定量试剂盒检测浓度，也可以肉眼比较电泳胶上 RNA 和 DNA 的强度。由于 RNA 是单链，跟核酸染料结合力低，因此同等亮度的 RNA 条带，其 RNA 分子数一般比 DNA 的分子数多一倍。1 μg DNA 模板一般可以合成 2-6μg 的 RNA（含带帽 RNA）。

得到的 RNA 可以放-80℃保存（溶液中有 DNA 模板和未使用的 NTP）。注：若需进一步去除 T3 转录反应体系中的 DNA 模板，可参考下列操作步

骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。

1.  在体外转录结束后，在反应体系中加入 3-5 U 自备的 RNase-free DNase。 2. 37℃保温 15-30 分钟。

3.补水到 100μL，

4.用自备的等体积（100μL）的 Tris 饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的 DNase和 RNA 聚合酶。

5.在上清中加 200μL 自备的微量核酸沉淀剂（CAT#50903；用前需要摇晃混匀），振荡后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。

6.加入 1mL 75%乙醇，震荡 10 秒后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。

7.短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。

8.晾干半分钟，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA?？扇苡?RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

选择我们的T3体外转录及加帽试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！