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試劑盒組成及儲存條件

Annexin V-AbFluor™ 488 細胞凋亡檢測試劑盒主要包括 Annexin V-AbFluor™ 488、碘化丙啶（PI）、Annexin V 結(jié)合緩沖液（5×）等成分。不同規(guī)格試劑盒各成分的量有所不同，如 20T 規(guī)格的試劑盒包含 2mL 的 Annexin V 結(jié)合緩沖液（5×）、100μL 的 Annexin V-AbFluor™ 488 和 40μL 的 PI 等。該試劑盒需在 -20°C 避光保存，有效期 12 個月。

操作步驟

細胞收集與洗滌

通過所需方法誘導細胞凋亡，同時培養(yǎng)無誘導的對照培養(yǎng)物。對于懸浮細胞，4℃、300g 離心 5min 收集 1-2×10?細胞，用冰預冷的 PBS 洗滌兩次。貼壁細胞需先用不含 EDTA 的胰酶消化，再離心收集細胞，同樣用 PBS 洗滌兩次。消化時間過長可能會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，從而出現(xiàn)細胞壞死的假陽性。

染色操作

用 100μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液重懸細胞，每 100μL 細胞懸液中加入 5μL Annexin V-AbFluor™ 488 和 2μL PI，輕輕混勻。室溫避光孵育 15min，孵育結(jié)束后置于冰上。孵育過程中可輕輕顛倒數(shù)次以加強染色效果。

檢測方法

• 流式細胞儀檢測 ：孵育結(jié)束后加入 400μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液，輕柔混勻后置于冰上。染色后 30min 內(nèi)通過流式細胞儀分析細胞。Annexin V-AbFluor™ 488 的激發(fā)波長為 491nm，發(fā)射波長為 517nm；PI 的激發(fā)波長為 535nm，發(fā)射波長為 617nm。在流式細胞儀的散點圖上，左下象限（Annexin V?/PI?）代表活細胞；右下象限（Annexin V?/PI?）代表早期凋亡細胞；右上象限（Annexin V?/PI?）代表凋亡晚期細胞和壞死細胞。

• 熒光顯微鏡檢測 ：對于懸浮細胞，按照上述流式細胞儀檢測的步驟操作后，將細胞懸浮置于玻片上，用蓋玻片蓋住細胞，盡快使用適當濾鏡通過熒光顯微鏡分析細胞。對于貼壁細胞，細胞接種于爬片或腔室載玻片上，誘導凋亡后，除去培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌細胞兩次，準備工作液，每 100μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液添加 5μL Annexin V-AbFluor™ 488 和 2μL PI，輕柔混勻后作用于細胞，室溫避光孵育 15-30min，用 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液洗滌細胞兩次，載玻片上添加一滴 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液，將細胞爬片置于載玻片上，對于細胞腔室載玻片上的細胞，添加足夠 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液覆蓋細胞，也可使用抗熒光淬滅封片劑封片，然后使用適當濾鏡在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項

• Annexin V-AbFluor™ 488 和 PI 使用前需平衡到室溫，且未使用的試劑分裝后在 -20°C 下保存，避光，避免反復凍融。

• Annexin V 結(jié)合緩沖液使用前需用去離子水稀釋至 1×，剩余試劑可在 4°C 下保存 6 個月。

• 染色后的細胞需在 30min 內(nèi)進行檢測，以免影響檢測結(jié)果。