在細胞生物學研究中，細胞骨架的觀察和分析對于理解細胞的形態(tài)、運動、分裂和信號傳導等過程至關重要。鬼筆環(huán)肽（Phalloidin），一種從毒蘑菇（Amanita phalloides）中分離出來的環(huán)狀多肽，能夠特異性地結(jié)合 F-肌動蛋白（F-actin），成為研究細胞骨架的理想工具。AbFluor™ 555-鬼筆環(huán)肽通過熒光標記技術，為研究人員提供了一種高效、靈敏的 F-actin 檢測方法。
鬼筆環(huán)肽是一種雙環(huán)肽類毒素，其內(nèi)部存在不尋常的硫醚橋連接半胱氨酸和色氨酸。這種結(jié)構賦予了鬼筆環(huán)肽相對的穩(wěn)定性，并使其能夠特異性地結(jié)合 F-肌動蛋白。當與熒光染料（如 AbFluor™ 555）偶聯(lián)后，鬼筆環(huán)肽可以用于熒光顯微鏡下觀察細胞骨架的分布和形態(tài)。
在生理條件下，鬼筆環(huán)肽與 F-肌動蛋白的結(jié)合非常穩(wěn)定，即使在較高鹽濃度和較寬的 pH 范圍內(nèi)也能保持結(jié)合活性。然而，當 pH 值升高時，硫醚橋會裂解，導致鬼筆環(huán)肽失去對 F-肌動蛋白的親和力。這一特性使得鬼筆環(huán)肽在不同實驗條件下能夠靈活應用。
AbFluor™ 555-鬼筆環(huán)肽常用的應用是對細胞骨架中的 F-actin 進行染色。在細胞固定后，鬼筆環(huán)肽與 F-actin 結(jié)合，發(fā)出明亮的紅色熒光，使研究人員能夠清晰地觀察到細胞骨架的分布和形態(tài)。這種染色方法廣泛用于各種細胞類型，包括貼壁細胞和懸浮細胞。
F-actin 在細胞遷移和形態(tài)變化中起著關鍵作用。通過 AbFluor™ 555-鬼筆環(huán)肽染色，研究人員可以在熒光顯微鏡下實時觀察細胞遷移過程中 F-actin 的動態(tài)變化，了解細胞骨架在細胞運動中的作用機制。
鬼筆環(huán)肽的毒性使其在藥物篩選和毒性研究中具有重要應用價值。研究人員可以利用 AbFluor™ 555-鬼筆環(huán)肽檢測藥物對細胞骨架的影響，評估藥物的潛在毒性。通過比較處理和未處理細胞的 F-actin 分布和含量變化，可以快速篩選出對細胞骨架有顯著影響的化合物。
在進行鬼筆環(huán)肽染色之前，需要準備好細胞樣本。對于貼壁細胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細胞，然后用適當?shù)木彌_液洗滌細胞，去除殘留的培養(yǎng)基成分。對于懸浮細胞，直接收集細胞并進行洗滌。將細胞固定在適當?shù)墓潭ㄒ褐?，?3.7% 甲醛，固定時間一般為 15 - 30 分鐘。固定后，用 PBS 洗滌細胞兩次，以去除固定液殘留。
將固定后的細胞用 0.1% - 0.5% 的 Triton X-100 處理 5 - 10 分鐘，以增加細胞膜的通透性，使鬼筆環(huán)肽能夠更好地進入細胞內(nèi)部。用 PBS 洗滌細胞兩次后，加入適量的 AbFluor™ 555-鬼筆環(huán)肽染色液，使其覆蓋細胞。鬼筆環(huán)肽的常用工作濃度為 1 - 10 μM，具體濃度需根據(jù)細胞類型和實驗需求進行優(yōu)化。將細胞與染色液在室溫下避光孵育 30 - 60 分鐘。
孵育完成后，用 PBS 輕輕洗滌細胞兩次，去除未結(jié)合的染色液。將細胞懸液或細胞涂片置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，F(xiàn)-actin 會呈現(xiàn)出明亮的紅色熒光，顯示出細胞骨架的分布和形態(tài)。對于需要長期保存的樣本，可以使用抗熒光淬滅劑封片，以延長熒光信號的穩(wěn)定性。
高特異性：鬼筆環(huán)肽能夠特異性地結(jié)合 F-肌動蛋白，確保染色信號準確反映細胞骨架的分布。
高靈敏度：AbFluor™ 555 染料具有明亮的熒光信號，能夠檢測到低豐度的 F-actin。
穩(wěn)定性：鬼筆環(huán)肽與 F-肌動蛋白的結(jié)合穩(wěn)定，熒光信號在較寬的 pH 和鹽濃度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。
多色熒光標記：AbFluor™ 555-鬼筆環(huán)肽可以與其他熒光染料聯(lián)合使用，實現(xiàn)多色熒光標記，為復雜細胞過程的研究提供更全面的視角。
染色濃度優(yōu)化：使用 AbFluor™ 555-鬼筆環(huán)肽時，需根據(jù)細胞類型和實驗需求優(yōu)化染色濃度。濃度過高可能導致非特異性染色，而濃度過低則可能使熒光信號不足。
避光操作：鬼筆環(huán)肽染料對光敏感，操作過程中應盡量減少樣本的光照時間，以防止熒光淬滅。
背景熒光控制：在染色過程中，需確保染色步驟的規(guī)范性，以減少背景熒光。例如，孵育后應充分洗滌細胞，去除未結(jié)合的染料。
保存條件：鬼筆環(huán)肽染料應密封保存于干燥、避光的環(huán)境中，避免接觸強光和高溫，以保持其活性和穩(wěn)定性。
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