谷胱gan肽还原酶（GR）活性测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱gan肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中 GR 被TrxR 取代）。GR 催化NADPH 还原GSSG 生成GSH，有助于维持体内 GSH/GSSG比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR 还参与抗坏血酸－谷胱gan肽循环途径。

测定原理：

GR 能催化NADPH 还原GSSG 再生GSH，同时NADPH 脱氢生成NADP⁺；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，相反NADP⁺在该波长无吸收峰；通过测定 340 nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算GR 活性。

谷胱gan肽还原酶（GR）活性测定试剂盒

组成：

试剂二：粉剂×2 支，-20℃保存。临用前加入 1.2ml 蒸馏水，混匀。试剂三：粉剂×2 支，-20℃保存。临用前加入 0.6ml 蒸馏水，混匀。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、和蒸馏水

粗酶液提?。?/span>

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃，离心 15min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

操作步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一置于 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）中预热 30min。

3. 测定管：取微量石英比色皿或 96 孔板，依次加入 10μl 试剂三，20μl 试剂二，150μl 试剂一，20μl 上清液，混匀，于 340nm 迅速测定初始吸光度和 180 s 吸光度，记为 A 测 1 和A 测 2，△A 测定管= A 测 1﹣A测 2。

注意：

1、加完上清液后必须迅速混匀测定，保证准确测出初始反应速度；

2、当出现初始 180s 内吸光值不稳定时，可以适当延长反应时间，选取相对稳定的时间段内吸光值变化值；

3、当所测△A 测定管的值在零点附近徘徊时，可能原因：（1）样本GR 酶活性低，建议浓缩样本后再进行测定；（2）样本GR 酶活性过高，吸光值变化区间过小无法准确测出，建议样本稀释 2~5 倍后再进行测定

计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷[Cpr×V 样]÷T

= 536×△A 测定管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/g 鲜重)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 536×△A 测定管÷W

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每 10⁴ 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹] ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

= 536×△A 测定管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/ml)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷×V 样÷T

= 536×△A 测定管

ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，200μl=2×10^-4 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/ml）；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μl =2×10^-2 ml；V 样总：提取液体积，1 ml；V 样总：提取液体积，1 ml；T：反应时间，3 min。 b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷[Cpr×V 样]÷T

= 1072×△A 测定管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/g 鲜重)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 1072×△A 测定管÷W

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每 10⁴ 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹] ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

=1072×△A 测定管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/ml)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷×V 样÷T

=1072×△A 测定管

ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×10³L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，200μl=2×10^-4 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/ml）；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μl =2×10^-2 ml；V 样总：提取液体积，1 ml；V 样总：提取液体积，1 ml；T：反应时间，3 min。

注意事项：

（1） 样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

（2） 试剂二和试剂三须现配现用，配制完后，置于冰上，未使用完的 4℃保存，三天内使用完。

（3） 测定前须先用 1～2 个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2～5 倍。

（4） 细胞中 GR 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GR 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。

谷胱gan肽还原酶（GR）活性测定试剂盒