膜蛋白在細胞的物質(zhì)運輸、信號轉(zhuǎn)導、增殖分化等許多生命活動中起著非常重要的作用，是重要的藥物靶點。然而，由于表達量低、構(gòu)象不穩(wěn)定、難分離純化等原因，許多研究受限于膜蛋白難表達而止步不前。
山東農(nóng)業(yè)大學某課題組就遇到這樣一個難題：某膜蛋白用原核體系難以表達，經(jīng)過兩年時間反復嘗試，仍未攻克難關(guān)。
珀羅汀生物基于自主研發(fā)的無細胞蛋白表達（CFPS）系統(tǒng)，已成功表達多例全長跨膜蛋白。該課題組慕名而來，在進一步了解CFPS技術(shù)以及珀羅汀生物在無細胞領(lǐng)域的技術(shù)優(yōu)勢之后，決定委托珀羅汀生物，利用CFPS平臺嘗試表達該膜蛋白。
測試方法
收到客戶質(zhì)粒后，珀羅汀生物研發(fā)人員立即著手構(gòu)建線性表達模板，為了直接觀測目標膜蛋白的表達情況并提高其可溶性，研發(fā)人員還構(gòu)建了融合GFP的表達模板。隨后，采用專研的針對膜蛋白的CFPS體系（即PLDK002試劑盒來源體系），并添加去垢劑【1】，于收到質(zhì)粒當天完成無細胞反應體系構(gòu)建。
實驗設(shè)計：
組別 | NC | A1 | A2 | B1 | B2 |
是否融合GFP | - | - | - | + | + |
是否添加去垢劑 | - | - | + | - | + |
純化標簽 | - | His標簽 | |||
注：【1】該去垢劑是依據(jù)珀羅汀生物膜蛋白表達案例庫的實驗數(shù)據(jù)選出。
測試結(jié)果
圖1融合GFP的目標膜蛋白在照膠儀下發(fā)出綠色熒光
次日，取反應后上清，進行親和純化、表達鑒定。如圖1所示，B1、B2兩組在照膠儀下均發(fā)出綠色熒光，提示融合GFP的目標膜蛋白無論是否添加去垢劑，均可在CFPS體系的上清液中可溶表達！
圖2 目標膜蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖
經(jīng)考染、脫色后，如圖2所示，未融合GFP的目標膜蛋白（A1、A2組）同樣在上清液中可溶表達！此外，分別對比A1、A2組與B1、B2組可以發(fā)現(xiàn)，添加去垢劑可促進該膜蛋白的可溶表達。
總結(jié)
珀羅汀CFPS系統(tǒng)不負眾望，兩天之內(nèi)，成功表達了困擾該課題組長達兩年的膜蛋白，“難表達蛋白的救星"名副其實！本次實驗的成功，再次顯示出珀羅汀CFPS技術(shù)在膜蛋白等難度蛋白表達領(lǐng)域中的絕倫。
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