ELISA法HBsAg假陽性和假陰性

  為了減少HBsAg檢測出現(xiàn)假陽性和假陰性，我們有必要對這種現(xiàn)象的原因進行分析，在實際的檢測工作中，造成HBsAg檢測出現(xiàn)假陽性和假陰性主要受以下因素影響，分述如下：

一、ELISA法假陰性原因

1. 標本用肝素或EDTA等抗凝處理易造成HBsAg檢測結(jié)果假陰性，肝素抗凝血漿會增加OD值,可能與高濃度肝素具有強大的負電荷,能吸附酶標記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中的辣根過氧化物酶活性，造成假陰性。


2. 標本保存不當,在冰箱內(nèi)保存過久的標本,血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體。標本放置時間延長（如一天以上），有時抗原或抗體免疫活性減弱，便出現(xiàn)假陰性。因此若采血后不能及時檢測，5天內(nèi)檢測標本分離血清置于4。C冰箱內(nèi)；超過5天不能檢測的，應(yīng)放在-20。C低溫冰箱中。


3. 低濃度HBsAg標本（弱陽性HBsAg）易受加樣時間（特別是大批量標本）、試劑平衡時間、溶血程度的影響，出現(xiàn)假陰性。如加樣時間在30分鐘內(nèi)的差異是zui大的。


4. 高濃度HBsAg在ELISA一步法檢測中易出現(xiàn)假陰性，即HBsAg的鉤狀效應(yīng)。從原理來講，一步法中HBsAg與包被板上的HBsAb及酶結(jié)合的HBsAb結(jié)合是雙向的，當HBsAg濃度過高時，HBsAg與包被板上的抗體及酶結(jié)合物中的抗體均是單向結(jié)合，不能形成抗體－抗原－抗體酶復合物，使酶標記抗體在隨后的洗板中洗掉，從而顯出陰性結(jié)果。但是在ELISA兩步法中，高濃度的HBsAg只能與包被的HBsAb“飽和"地結(jié)合，多余部分被洗掉，隨后加入的酶結(jié)合的HBsAb正好通過HBsAg的“橋梁"作用而結(jié)合在酶標板上，顯示陽性結(jié)果。因此當HBsAg強濃度時用ELISA一步法檢測存在假陰性現(xiàn)象。解決此問題的zui hao辦法有：對標本進行稀釋；不單檢測HBsAg；采用ELISA兩步法檢測可消除漏檢現(xiàn)象。


5. 由于慢性病毒攜帶者(低水平HBsAg攜帶者)或HBV感染的潛伏期,HBsAg濃度低于檢測水平的下限，由此造成假陰性。


6. S基因突變導致HBsAg的氨基酸結(jié)構(gòu)改變，由于多數(shù)商用試劑盒檢測系統(tǒng)采用的為多克隆抗體檢測HBsAg的a決定簇，這一區(qū)域的點突變即可導致臨界觀測值或陰性結(jié)果，造成假陰性。


二、ELISA法假陽性原因

1. 溶血或紅細胞：有國內(nèi)報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性，因紅細胞破壞溶解時釋放出大量血紅蛋白，血紅蛋白的亞鐵血紅素具有弱過氧化物酶活性，其作用效應(yīng)與辣根過氧化物酶（HRP）類似，能與預包被抗體（Ab）結(jié)合，一步法洗脫步驟往往難以wan全洗脫，殘留的過氧化物酶催化底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生假陽性。因此在采集血標本時，量不能太少，操作過程中如果血清混濁，一定要離心后再吸樣，避免紅細胞加入造成假陽性。對于溶血的標本zui重新采集血液，進行重新檢測。


2.  標本凝集不全或標本離心處理時采用不同的離心轉(zhuǎn)速和離心時間,也可造成假陽性結(jié)果。若在血液還未開始凝固時即強行分離血清，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；離心轉(zhuǎn)速過低或離心時間過短，由于血液離心不充分均可導致假陽性。解決的辦法zui是血液標本采集后放水浴箱，使其充分凝固再用3000rpm,離心15分鐘再分離血清。


3. 干擾物質(zhì)的影響：如類風濕因子（RF）、補體、AFP等可以造成HBsAg檢測結(jié)果假陽性。RF因子可與標記二抗的Fc段結(jié)合造成假陽性；補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56。C30分鐘滅活補體可降低假陽性率；高濃度的AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導致本底過深造成假陽性結(jié)果。


4. 某些細菌污染標本(如表皮球菌等),菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，造成檢測結(jié)果假陽性。