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高血脂動物造模! 細(xì)胞外囊泡如何熒光成像？更有 PPARα 抑制劑 GW6471

閱讀：77 發(fā)布時間：2025-6-27
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承蒙數(shù)十萬科學(xué)家信賴， MCE 文獻引用已高達 50,000+！本期內(nèi)容來自 MCE 客戶--廣西大學(xué)的楊興珍投稿，經(jīng)本人同意后編輯發(fā)布。親愛的 MCE 科研伙伴，如果您有使用 MCE 產(chǎn)品的經(jīng)驗心得，歡迎文末掃碼私信，投稿分享~

本期實操案例
(1) 高脂血癥模型鼠的構(gòu)建
(2) 小分子抑制劑探索高脂代謝機制的口服使用方案
(3) 熒光染料標(biāo)記細(xì)胞外囊泡的活體示蹤。
Section.01
客戶投稿
【基本信息】
1. 論文標(biāo)題
英文標(biāo)題：HLF and PPARα axis regulates metabolic-associated fatty liver disease through extracellular vesicles derived from the intestinal microbiota
中文標(biāo)題：HLF/PPARα 軸通過源自腸道微生物的細(xì)胞外囊泡調(diào)節(jié) MAFLD
2. 第一作者：楊興珍（通訊作者：李一星周磊）
3. 第一作者單位：廣西大學(xué)
4. 發(fā)表時間：2025 年 4 月 7 日
5. 影響因子 (IF)：33.2 (2024 IF)
6. 文獻引用 MCE 產(chǎn)品：
GW6471 (HY-15372) 在本研究中用于小鼠口服，探索抑制 PPARα 改善高脂代謝的機制。
Tyloxapol (HY-B1068) 在本研究中用于構(gòu)建高脂血癥小鼠，探索脂肪酸攝取。
Sulfo-Cy7.5 NHS ester (HY-D1568) 在本研究中用于標(biāo)記細(xì)胞外囊泡，探索細(xì)胞外囊泡的活體示蹤。
BODIPY 581/591 C11 (HY-D1301) 在本研究中用于處理細(xì)胞，探索脂質(zhì)過氧化水平。
作者對腸道在代謝性功能障礙相關(guān)脂肪肝病 (MAFLD) 發(fā)生中的具體機制進行了全面研究。利用食蟹猴單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)腸道肝白血病因子 (Hepatic leukemia factor, HLF) 是一個新的腸道脂質(zhì)吸收調(diào)控基因，在自發(fā)性脂肪肝食蟹猴腸道中表達量均上調(diào)。
特異性敲除 HLF 可通過抑制過氧化物酶體增殖激活受體 α (PPARα) 并恢復(fù)腸道屏障來改善 MAFLD。機制研究表明，HLF/PPARα 軸調(diào)節(jié)腸道菌群衍生的細(xì)胞外囊泡 (fEV)；該囊泡通過腸肝循環(huán)抑制肝細(xì)胞鐵死亡并減少肝臟脂肪變性。脂質(zhì)組學(xué)和功能分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)合膽汁酸?；蛆Z去氧膽酸 (TCDCA) 是 fEV 降脂作用的關(guān)鍵驅(qū)動因素。這些發(fā)現(xiàn)為 MAFLD 提供了新的治療策略。
圖 1. HLF/PPARα 軸通過源自腸道微生物的細(xì)胞外囊泡調(diào)節(jié) MAFLD^[1]。
文章亮點
腸道特異性缺乏 HLF 可改善 MAFLD。
HLF 通過 PPARα 在脂肪代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。
HLF/PPARα 軸調(diào)節(jié)腸道微生物群并影響腸道微生物衍生的 fEV 的組成。
TCDCA是 fEVs 改善 MAFLD 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。
Section.02
MCE 產(chǎn)品引用
引用產(chǎn)品 1：誘導(dǎo)疾病模型類
Tyloxapol (HY-B1068) 在本研究中用于構(gòu)建高脂血癥小鼠，探索脂肪酸攝取。
實驗步驟
小鼠禁食 16 小時后，腹腔注射 Tyloxapol (500 mg/kg；HY-B1068)。
引用產(chǎn)品 2：活性小分子類
GW6471 (HY-15372) 在本研究中用于小鼠口服，探索抑制 PPARα 改善高脂代謝的機制。

實驗步驟
1. 購買 6 周齡雄性 C57BL/6 小鼠，在 8 周齡時，將小鼠隨機分為兩組 (每組 6-8 只)：(1) 高脂飲食組 (HFD 組)，喂食高脂飲食 (HFD, 5.5 kcal/g) 并灌胃生理鹽水；(2) HFD + GW6471 組，喂食高脂飲食并灌胃 GW6471 (10 mg/kg；HY-15372)。
2. 在高脂飲食喂養(yǎng) 4 周后，從 12 周齡開始，每隔一天通過口服 GW6471，持續(xù) 8 周。
3. 在整個實驗過程中，小鼠可自由攝食和飲水，并維持在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下 (溫度：25 ± 2°C，濕度：50 ± 5%，12 小時光照/黑暗循環(huán))。
圖 2. 小鼠實驗設(shè)計示意圖^[1]。
引用產(chǎn)品 3：熒光染料類
在本期的客戶文獻中，作者同時用到了熒光染料 Sulfo-Cy7.5 NHS ester (HY-D1568) 和 BODIPY 581/591 C11 (HY-D1301)。
熒光染料 (Dyes) 是一種非特異性檢測方法，能與 DNA 結(jié)合，通常用于實時熒光定量 PCR (qPCR) 中，能隨著 DNA 擴增量增加而熒光強度增加，從而實現(xiàn)定量分析，檢測范圍廣。它們不需要特殊的探針序列，通常是單分子或雙分子。
Sulfo-Cy7.5 NHS ester (HY-D1568)：在本研究中用于標(biāo)記細(xì)胞外囊泡，探索細(xì)胞外囊泡的活體示蹤。

實驗步驟
1. 將 fEVs 與 Sulfo-Cy7.5 NHS ester (HY-D1568) 在室溫下孵育 6 小時，隨后使用 30 kDa 超濾管進行濃縮和純化。
2. 將熒光標(biāo)記的 fEVs (總蛋白 20 μg) 通過口服灌胃給予每只小鼠。在給藥后 3、6、12 和 24 小時，使用 IVIS-MARS 系統(tǒng)進行體內(nèi)成像。
3. 24 小時后，對小鼠實施，并對心臟、肝臟、脾臟、腎臟和腸道進行成像。

實驗結(jié)果
體內(nèi)追蹤顯示 fEVs 在大約 6 小時內(nèi)到達肝臟，24 小時后信號減弱 (圖 5A)。組織成像顯示 fEVs 在肝臟和腸道中積聚 (圖 3)。
圖 3. 熒光標(biāo)記的 fEVs 在小鼠體內(nèi)和組織中的示蹤 (n=3)^[1]。

BODIPY 581/591 C11 (HY-D1301)：在本研究中用于處理細(xì)胞，探索脂質(zhì)過氧化水平。
實驗步驟
1. 脂質(zhì)過氧化熒光染色使用 BODIPY 581/591 C11 熒光探針 (HY-D1301) 進行。
2. 將 1 mg BODIPY 581/591 C11 溶解在 0.1983 mL DMSO 中以獲得 10 mM BODIPY 581/591 C11。
3. 在無血清細(xì)胞培養(yǎng)中稀釋儲備液培養(yǎng)基取 10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液。4. 首先細(xì)胞在 24 孔板中培養(yǎng) 24 h，之后，加藥處理細(xì)胞 24 h。
5. 隨后，用 PBS 清洗細(xì)胞，加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液，室溫孵育 30 分鐘。
6. 避光清洗細(xì)胞 3 次，通過酶標(biāo)儀檢測紅色熒光 (還原型；Ex=581 nm, Em=591 nm)，與脂質(zhì)結(jié)合后會產(chǎn)生綠色熒光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm)。數(shù)據(jù)以紅光強度/綠光強度比值表示。

實驗結(jié)果
如下圖，實驗表明，TCDCA (fEVs 改善 MAFLD 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子) 可降低氧化應(yīng)激 (氧化應(yīng)激可增加脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和細(xì)胞因子的釋放, 介導(dǎo) NAFLD 的發(fā)生發(fā)展)。
圖 4. HepG2 細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化的熒光圖像及定量分析 (n?=4)^[1]。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計
所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (SD) 表示。使用雙向重復(fù)測量方差分析 (ANOVA) 比較兩條曲線在多個時間點的趨勢。Friedman 檢驗用于四組隨時間重復(fù)測量的比較。兩組之間的統(tǒng)計比較采用 Student's t 檢驗，而多組比較則使用單因素方差分析。所有分析在 GraphPad Prism 9.0 或 SPSS 26.0 進行。P 值 <0.05（*）或 <0.01（**）被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。圖中不同字母表示組間存在顯著差異。
Section.03
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Section.04
小結(jié)
再次恭喜我們的客戶成功發(fā)刊！該研究提出腸道特異性缺乏 HLF 改善 MAFLD，HLF/PPARα 軸通過腸道微生物來源的 fEVs 調(diào)節(jié)腸肝循環(huán)和抑制肝細(xì)胞鐵死亡，從而改善 MAFLD。結(jié)果顯示，結(jié)合型膽汁酸 TCDCA 為 fEVs 降脂作用的關(guān)鍵分子。這些發(fā)現(xiàn)闡明了腸道 HLF 在調(diào)節(jié) MAFLD 中的功能，并為治療該疾病提供了新的途徑。
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Tyloxapol (HY-B1068)
Tyloxapol 是一種烷基芳基聚醚醇型非離子液體聚合物，用作表面活性穩(wěn)定劑。Tyloxapol 用于誘導(dǎo)動物高脂血癥。
GW6471 (HY-15372)
GW6471 是一種有效的 PPARα 拮抗劑。
Sulfo-Cy7.5 NHS ester (HY-D1568)
Sulfo-Cy7.5 NHS ester 是一種近紅外水溶性親水性染料，也是一種用于胺基改性的 NHS 酯。Sulfo-Cy7.5 NHS ester 包含一個三甲基炔橋，并有一個連接臂，用于其連接到蛋白質(zhì)，多肽和其他分子。Sulfo-Cy7.5 NHS ester 可用于近紅外成像應(yīng)用的研究。
BODIPY 581/591 C11 (HY-D1301)
BODIPY 581/591 C11 是一種 BODIPY 氟硼熒衍生物，具有良好的光穩(wěn)定性、低熒光偽影特質(zhì)。BODIPY 581/591 C11 常用于活細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和抗氧化性能的研究，或與羥基自由基反應(yīng)、檢測鐵死亡。BODIPY 581/591 C11 本身為紅色熒光 (還原型；Ex=581 nm, Em=591 nm)，與脂質(zhì)結(jié)合后會產(chǎn)生綠色熒光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm)。
[1] Yang X, Wang J, Qi X, Hou M, Liu M, Xiao Y, Liu S, Zhou J, Yu J, Wang Y, Chen G, Yu L, Batchuluun K, Batsaikhan B, Damba T, Liang Y, Liang X, Ma J, Liang Y, Li Y, Zhou L. HLF and PPARα axis regulates metabolic-associated fatty liver disease through extracellular vesicles derived from the intestinal microbiota. Imeta. 2025 Apr 7;4(2):e70022.

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