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黃曲霉毒素B1檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測谷物、飼料等樣本中的黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的黃曲霉毒素B1和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗黃曲霉毒素B1抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含黃曲霉毒素B1含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中黃曲霉毒素B1的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.03ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測下限：
谷物…………………………………………0.15ppb
玉米皮、麩皮等吸水性強(qiáng)樣本……………0.6ppb
食用油、花生油……………………………0.6ppb
醬類、餅干、糕點(diǎn)等食品或調(diào)料…………0.6ppb
啤酒…………………………………………0.3ppb
葡萄酒、醬油、醋…………………………0.15ppb
茶葉…………………………………………0.2ppb
麥類…………………………………………1.2ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
黃曲霉毒素B1…………………………100%
2.5 樣本回收率：
谷物…………………………………85±15%
花生油………………………………82±15%
食用油………………………………85±15%
醬類、餅干、糕點(diǎn)等食品或調(diào)料…83±15%
啤酒…………………………………84±15%
葡萄酒、醬油、醋…………………87±15%
茶葉、麥類…………………………75±15%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.03ppb、0.06ppb、0.12ppb、0.24ppb、0.48ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液：100ppb …………………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋） …………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋） ………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說明書 ………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：甲醇、正己烷、
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：樣本提取液
70%甲醇，即V甲醇:V去離子水=7：3。
配液2：工作洗滌液
將20×濃縮洗滌液20倍稀釋(1份20×濃縮洗滌液加19份去離子水)。
配液3：樣本復(fù)溶液
35%甲醇，即V甲醇:V去離子水=3.5：6.5。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 谷物處理方法
1）稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加5ml樣本提取液（配液1），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；
3）取50µl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：5 檢測下限：0.15ppb
5.3.2 玉米皮、麥麩等吸水性強(qiáng)樣本處理方法
1）稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加20ml樣本提取液（配液1），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；（對于毒素含量的樣本可用樣本復(fù)溶液（配液3）稀釋后再測。比如取2）中的混合液0.1ml加0.9ml樣本復(fù)溶液（配液3）混勻，最終樣本稀釋倍數(shù)為200，檢測下限為6ppb。）
3）取50µl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20 檢測下限：0.6ppb
注：由于毒素在樣本中的分布呈非均勻狀態(tài)，取樣時需多點(diǎn)取樣充分混勻后再取2g進(jìn)行試驗(yàn)。
5.3.3 食用油、花生油處理方法
1）稱取2ml樣本于50ml離心管中，加8ml正己烷和10ml樣本提取液（配液1），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）去除上層液體，取0.5ml下層液體加入0.5ml去離子水，混勻，再取混勻液體0.5ml加入0.5ml樣本復(fù)溶液（配液3），振蕩30s；
3）取50µl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20 檢測下限：0.6ppb
5.3.4 醬類、餅干、糕點(diǎn)等食品或調(diào)料處理方法
1）稱取1g±0.05g粉碎樣本至15ml離心管中，加10ml甲醇，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
2）取2ml上清至15ml離心管中，于50℃-60℃下氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>
3）加入2ml去離子水，振蕩30s，再加入6ml，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
4）取下層液1.5ml至10ml離心管，于50℃-60℃下氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>
5）加入0.5ml正己烷，振蕩30s，再加入1ml樣本復(fù)溶液（配液3），振蕩1分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
6）去除上層有機(jī)物相，取下層清液50µl分析。。
樣本稀釋倍數(shù)：20倍 檢測下限：0.6ppb
5.3.5 啤酒處理方法
1）將啤酒充分?jǐn)嚢瑁ㄈコ趸迹?，?ml啤酒樣本，加入1ml蒸餾水，再加入7ml甲醇，振蕩5分鐘；
2）取混勻后的樣本液0.5ml加入0.5ml去離子水，混勻；
3）取50µl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：10 檢測下限：0.3ppb
5.3.6 葡萄酒、醬油、醋處理方法
1）取2ml樣本，加入2ml蒸餾水，再加入10ml，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取下層液體1ml于50-60℃下氮?dú)饣蚩諝庀麓蹈桑?/span>
3）加入0.5ml樣本提取液（配液1）充分溶解干燥物，再加入0.5ml去離子水，混勻；
4）取50µl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：5 檢測下限：0.15ppb
5.3.7 茶葉處理方法
1）稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加4ml甲醇溶液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取0.3ml上清，加入0.6ml去離子水，混勻；
3）取50µl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：6 檢測下限：0.2ppb
5.3.8 麥類處理方法
1）稱取1g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加入2ml樣本提取液（配液1），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取0.2ml上清，加入0.2ml去離子水，振蕩30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
3）取離心后的樣本液0.1ml加入0.9ml樣本復(fù)溶液（配液3），混勻。
4）取50µl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：40 檢測下限：1.2ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 編 號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗 滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350µl工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯 色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。
6.5 終 止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
A0 |
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）
8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
