细胞的应力松弛测试是研究其粘弹性行为的重要手段，通过观察细胞在恒定形变下应力随时间衰减的过程，可以量化细胞骨架的弹性恢复能力和粘性耗散特性。以下是详细的测试方法说明，涵盖实验技术、操作流程、数据分析和注意事项：

一、常用实验技术

1. 原子力显微镜（AFM）/ 纳米压痕

• 原理：利用纳米级探针施加局部压缩或拉伸形变，通过检测探针偏转测量应力。

• 步骤：

1. 探针校准：选用球形探针，通过力-距离曲线校准弹性系数。

2. 细胞固定：将细胞培养在软基底（如PDMS凝胶）或刚性基底（如玻璃）。

3. 施加形变：探针以恒定速度压入细胞表面至预设深度（如500 nm），保持形变恒定。

4. 记录应力衰减：监测探针受力随时间的变化（通常持续10秒至5分钟）。

5. 数据处理：扣除基底效应，将探针受力转化为细胞应力。

2. 微管吸吮（Micropipette Aspiration）

• 原理：通过负压吸引细胞膜进入微管，测量吸入长度对应的应力变化。

• 步骤：

1. 微管制备：玻璃微管拉制为直径2-5 μm的，内充培养基。

2. 细胞吸附：通过微弱负压将细胞吸附于微管口。

3. 施加形变：增加负压使细胞膜吸入微管至固定长度（如10 μm），维持吸入长度。

4. 应力监测：通过压力传感器记录负压随时间衰减（反映细胞应力松弛）。

5. 模型拟合：常用液体滴模型（Liquid Drop Model）分析细胞膜张力。

3. 光学镊子（Optical Tweezers）

• 原理：利用激光捕获微珠，通过微珠位移施加形变并测量反作用力。

• 步骤：

1. 微珠功能化：将微珠（如聚苯乙烯）包被细胞黏附分子（如纤连蛋白）。

2. 细胞-微珠结合：将微珠与细胞表面受体结合，形成力学连接。

3. 施加形变：移动激光焦点拉伸细胞至固定位移。

4. 力衰减记录：通过微珠布朗运动分析光阱刚度，计算作用力衰减。

5. 时间分辨率：适用于毫秒级快速松弛过程的观测。

4. 微流控压缩装置

• 原理：通过微通道结构或可变形膜对细胞施加均匀压缩形变。

• 步骤：

1. 细胞加载：将细胞悬浮液注入微流控芯片。

2. 压缩控制：通过气压或机械驱动使柔性膜变形，压缩细胞至固定体积。

3. 压力监测：集成压阻传感器实时记录压缩力衰减。

4. 高通量优势：可同时测试多个细胞，适用于统计力学分析。

二、实验流程关键步骤

1. 细胞准备与活性控制

• 培养条件：使用含血清培养基维持细胞活性，实验全程在37°C、5% CO?环境中进行。

• 基底选择：

• 软基底（如1-10 kPa凝胶）：模拟体内微环境，减少边界效应。

• 硬基底（如玻璃）：简化力学模型，适合高精度AFM测试。

2. 形变施加的注意事项

• 加载速率：形变施加需足够快（如1-10 μm/s），避免在加载阶段引入粘性响应。

• 形变量控制：

• 小形变（<10%应变）：保证线性粘弹性响应。

• 大形变（>20%应变）：研究非线性行为（如细胞骨架重构）。

3. 数据采集与降噪

• 采样频率：

• 快速松弛（<1秒）：kHz级采样（如光学镊子）。

• 慢速松弛（>10秒）：1-10 Hz采样（如AFM）。

• 噪声处理：

• 使用低通滤波器消除高频振动噪声。

• 多次重复实验取平均值（至少10个细胞）。

三、数据分析与模型拟合

1. 应力松弛曲线特征

四、应用案例与注意事项

1. 疾病研究示例

• 癌细胞应力松弛：转移性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）相比正常乳腺细胞（MCF-10A）表现出更快的应力松弛（?τ更小），提示细胞骨架动态性增强。

2. 常见问题与解决

• 细胞脱离基底：

• 对策：增加黏附蛋白（如胶原涂层）或降低加载力。

• 应力衰减：

• 原因：实验时间不足或细胞骨架高度交联。

对策：延长记录时间至平衡态，或验证模型是否需引入G∞项。
仪器漂移

仪器漂移：

• 对策：在无细胞区域进行基线校正，使用温控系统减少热漂移。

五、前沿技术拓展

• 活细胞成像结合力学测试：

• 使用荧光标记细胞骨架（如F-actin、微管），同步观测力学松弛与结构重组。

• 高通量微流控芯片：

• 集成数百个微腔体，并行测试细胞群体力学异质性。

• 动态力谱（DFS）：

• 在不同加载速率下测试，揭示能量势垒与分子键动力学。

通过以上方法，研究者能够精确量化细胞的应力松弛特性，为理解细胞力学在生理与病理过程中的作用提供关键数据。

pavone纳米压痕细胞松弛测试

使用pavone纳米压痕保持深度不变；保持2s;上图为load-indentation曲线；下图为load-time曲线