PRM分析優(yōu)化指南：如何在Orbitrap平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)精確定量？檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹

在dànbáizhì組學(xué)研究中，PRM（Parallel Reaction Monitoring）技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高而被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)志物驗(yàn)證、機(jī)制研究與生物藥開發(fā)等領(lǐng)域。尤其是在高分辨率質(zhì)譜平臺(tái)Orbitrap上的應(yīng)用，使得PRM的定量準(zhǔn)確性和重復(fù)性達(dá)到新的高度。然而，實(shí)現(xiàn)真正的jīngquè定量并非僅依賴于儀器性能，更需在樣本準(zhǔn)備、方法開發(fā)、參數(shù)設(shè)定、數(shù)據(jù)采集與分析等每一環(huán)節(jié)精益求精。本文將系統(tǒng)解析如何在Orbitrap平臺(tái)上優(yōu)化PRM分析流程，幫助研究人員提升數(shù)據(jù)質(zhì)量與研究效率。

一、樣本制備：jīngzhǔn定量的前提保障

1、樣本類型與保存策略

PRM分析對(duì)樣本質(zhì)量極為敏感，推薦使用以下類型：

（1）組織樣本： 腫瘤、心腦組織等需快速冷凍，-80℃儲(chǔ)存；

（2）細(xì)胞樣本： 采用yíméi消化或刮板收集，加入裂解液立即處理；

（3）體液樣本： 如血清、血漿、腦脊液等，采集后應(yīng)快速離心除雜、分裝冷凍。

避免多次凍融是確保蛋白完整性和定量一致性的關(guān)鍵。

2、蛋白提取與消化標(biāo)準(zhǔn)化

（1）裂解液選擇： RIPA適用于多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，8M尿素用于難溶蛋白提取。

（2）還原與烷基化： 使用DTT（或TCEP）還原二硫鍵，IAA封閉游離巰基，保障酶解一致性。

（3）酶解： 常規(guī)使用Trypsin按1:50比例（酶:底物）過夜酶解，37℃保溫；

（4）純化： 采用C18柱純化脫鹽去雜質(zhì)，提高肽段質(zhì)量與MS兼容性。

確保前處理一致性是實(shí)現(xiàn)jīngquè定量的基礎(chǔ)，建議引入QC樣本監(jiān)控操作波動(dòng)。

二、靶標(biāo)肽段篩選與穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)設(shè)計(jì)

1、肽段篩選邏輯

（1）來源多樣： 可基于DDA結(jié)果、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)或公共數(shù)據(jù)庫（如PeptideAtlas）；

（2）篩選標(biāo)準(zhǔn)： 不含修飾位點(diǎn)、跨膜區(qū)域與共享肽段，保留時(shí)間穩(wěn)定、響應(yīng)強(qiáng)；

（3）目標(biāo)數(shù)量： 單項(xiàng)目推薦每個(gè)蛋白選2-3個(gè)高質(zhì)量肽段用于驗(yàn)證。

2、內(nèi)標(biāo)肽（SIS）設(shè)計(jì)與應(yīng)用

（1）合成方式： 通常使用13C/15N標(biāo)記氨基酸標(biāo)記目標(biāo)肽段；

（2）加入時(shí)機(jī)： 建議于酶解后加入，避免因樣本處理損耗帶來的誤差；

（3）定量模式： 可用于相對(duì)定量（歸一化）或構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)juéduì定量。

內(nèi)標(biāo)的存在極大提升了PRM的重復(fù)性與跨批次一致性，是jīngquè定量bùkěhuòquē的關(guān)鍵。

三、方法開發(fā)與Orbitrap參數(shù)優(yōu)化指南

1、質(zhì)譜方法設(shè)置

（1）前體離子選擇： 根據(jù)響應(yīng)強(qiáng)度、碎片譜圖選擇主m/z值；

（2）碎片離子設(shè)定： 選取多個(gè)強(qiáng)度高、無干擾的碎片離子，確保定量準(zhǔn)確；

（3）RT窗口安排： 使用RT scheduling功能jīngzhǔn采集，提高采集效率與特異性；

2、Orbitrap平臺(tái)核心參數(shù)

（1）分辨率： 建議設(shè)置在30,000–60,000（MS2），高分辨提高背景分離能力；

（2）注入時(shí)間（IT）與AGC： 通常設(shè)置IT為80–150ms，AGC target為1e5–2e5，根據(jù)靶點(diǎn)強(qiáng)度優(yōu)化；

（3）Isolation Window： 設(shè)定為1.2–2.0 Th，兼顧靈敏度與特異性；

（4）動(dòng)態(tài)排除： 開啟有助于避免干擾重復(fù)掃描，提高采集效率。

四、數(shù)據(jù)采集與Skyline分析流程詳解

1、原始數(shù)據(jù)采集要點(diǎn)

（1）QC策略： 每10個(gè)樣本注入一次QC樣本，監(jiān)控儀器狀態(tài)與樣本一致性；

（2）監(jiān)控指標(biāo)： 總離子流（TIC）、保留時(shí)間穩(wěn)定性、SIS峰響應(yīng)、背景噪聲水平等；

2、Skyline分析流程全解析

（1）導(dǎo)入raw文件與PRM方法配置： 設(shè)置靶標(biāo)序列、m/z值、RT窗口；

（2）提取XIC與峰識(shí)別： 自動(dòng)調(diào)用碎片離子色譜圖，選擇峰面積zuì大區(qū)域；

（3）RT校準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)比值計(jì)算： 校正保留時(shí)間偏移，計(jì)算SIS/Target比值；

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合（如適用）： 構(gòu)建線性擬合曲線，計(jì)算LOD/LOQ；

（5）批量歸一化與可視化： 使用熱圖、火山圖、PCA呈現(xiàn)結(jié)果；

（6）統(tǒng)計(jì)分析： 進(jìn)行t檢驗(yàn)、ANOVA、多重假設(shè)校正等。

Skyline的使用貫穿PRM數(shù)據(jù)處理始終，是提升定量效率與質(zhì)量的核心工具。

五、優(yōu)化建議與常見問題解答（FAQ）

Q1：低豐度蛋白信號(hào)弱，如何優(yōu)化？

優(yōu)化酶解條件或使用免疫富集策略；延長(zhǎng)質(zhì)譜注入時(shí)間，提高靶肽捕獲能力；優(yōu)選響應(yīng)更強(qiáng)、背景干擾更低的替代表肽段。

Q2：靶點(diǎn)過多采集不全怎么辦？

啟用時(shí)間窗口調(diào)度（RT scheduling），避免同時(shí)間掃描過多肽段；按功能或表達(dá)量分批采集，或采用多輪運(yùn)行策略。

Q3：結(jié)果波動(dòng)大，可能的原因？

內(nèi)標(biāo)響應(yīng)不穩(wěn)：建議更換或重新合成SIS；酶解效率波動(dòng)：增加QC樣本，監(jiān)控酶解一致性；儀器狀態(tài)不穩(wěn)：定期維護(hù)并做好每日性能驗(yàn)證。

百泰派克生物科技憑借豐富的靶標(biāo)經(jīng)驗(yàn)與強(qiáng)大的Orbitrap Exploris平臺(tái)，建立了標(biāo)準(zhǔn)化、高通量的PRM分析服務(wù)體系，服務(wù)涵蓋：

• 靶標(biāo)選擇與SIS合成建議

• 方法開發(fā)與Skyline模板配置

• 多樣本、跨批次標(biāo)準(zhǔn)化分析

• 可視化報(bào)告（含火山圖、熱圖、PCA）+ RAW原始圖譜交付

我們支持癌癥、代謝病、炎癥、自免等多領(lǐng)域研究，從科研探索到臨床轉(zhuǎn)化，提供zhídexìnlài的技術(shù)支撐。PRM不僅僅是一種定量手段，它是連接“發(fā)現(xiàn)"與“驗(yàn)證"的核心橋梁。要在Orbitrap平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)真正可靠的dànbáizhì定量結(jié)果，必須從樣本質(zhì)量、靶標(biāo)選擇、內(nèi)標(biāo)引入、參數(shù)設(shè)定到數(shù)據(jù)處理全過程優(yōu)化。百泰派克生物科技通過多年實(shí)踐與技術(shù)積累，為科研人員提供高覆蓋率、高重復(fù)性、高解讀力的PRM解決方案。讓每一次分析，不止于結(jié)果，更指向科學(xué)的深度洞察。

百泰派克生物科技特色項(xiàng)目

一、蛋白測(cè)序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測(cè)序系統(tǒng)對(duì)dànbáizhì序列進(jìn)行分析，提供基于質(zhì)譜的蛋白測(cè)序分析服務(wù)，包括對(duì)dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù)。對(duì)于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測(cè)序法的dànbáizhì從頭測(cè)序服務(wù)，對(duì)蛋白序列進(jìn)行分析。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1.采用目前世界上*的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實(shí)現(xiàn)對(duì)所測(cè)定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測(cè)定蛋白N端多達(dá) 70個(gè)氨基酸序列;

4.可測(cè)定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測(cè);

6.測(cè)序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學(xué)

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺(tái)結(jié)合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學(xué)、靶向dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù)。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù)，助力微量樣本蛋白組學(xué)、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1 .高通量定量蛋白分析:多對(duì)照組大規(guī)模實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標(biāo)記方法，適用于分析組織、細(xì)胞、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)度高;

4.可檢測(cè)較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學(xué)分析，分析更系統(tǒng)準(zhǔn)確。

三、單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析，采用金屬元素標(biāo)記物（通常是金屬元素標(biāo)記的特異抗體）標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部的分子，然后用流式細(xì)胞原理分離單個(gè)細(xì)胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個(gè)細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子表達(dá)量。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1.技術(shù)*，*技術(shù)空白

采用金屬標(biāo)記抗體技術(shù)，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細(xì)胞層面上對(duì)多種指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行表征，百泰派克生物科技可做到同時(shí)檢測(cè)51個(gè)目標(biāo)蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細(xì)胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細(xì)胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個(gè)左右，而流式質(zhì)譜技術(shù)一次（單樣本）就可分析至少10^5的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了數(shù)量級(jí)的提高，且成本不高于單細(xì)胞RNAseq。

3.應(yīng)用前景大

①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細(xì)胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機(jī)制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標(biāo)簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會(huì)有新應(yīng)用方向。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達(dá)量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實(shí)現(xiàn)10,000個(gè)以上I型多肽和10,000個(gè)以上II型多肽的鑒定和識(shí)別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺(tái)進(jìn)行免疫肽組學(xué)分析，可從zuì小的樣品材料中進(jìn)行可重復(fù)的識(shí)別和定量。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標(biāo)。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，MALDI TOF，高效色譜分離技術(shù)，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù)，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測(cè)平臺(tái)

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測(cè)和項(xiàng)目驗(yàn)證等zhuānyè服務(wù)。公司實(shí)驗(yàn)室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則，通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認(rèn)證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設(shè)備定期計(jì)量/期間核查，軟件審計(jì)追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù)，支持新藥研發(fā)、藥物申報(bào)注冊(cè)和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測(cè)分析服務(wù)；

2.獲國(guó)家CNAS實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)；

3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細(xì)胞分析、單細(xì)胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等；

4.七大質(zhì)量控制檢測(cè)平臺(tái)，滿足您一站式服務(wù)需求；

5.服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

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