細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)
近年來(lái)，致力于活細(xì)胞成像（Live Cell Imaging *又被稱為活細(xì)胞成像、延時(shí)拍攝成像）的研究人員不斷增加。因?yàn)檫@種方式無(wú)需固定細(xì)胞，可觀察細(xì)胞原始結(jié)構(gòu)變化。但是，以活細(xì)胞為對(duì)象的觀察難度高，會(huì)耗費(fèi)很長(zhǎng)的觀察時(shí)間，經(jīng)常會(huì)有研究者因此失敗。
為此，我們特意面向備受活細(xì)胞成像失敗困擾及今后要開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)的人士，匯總了常見(jiàn)的3大失敗事例及其對(duì)策，現(xiàn)介紹如下。
活細(xì)胞成像的失敗事例1：細(xì)胞衰弱
活細(xì)胞成像的失敗事例2：焦點(diǎn)模糊
活細(xì)胞成像的失敗事例3：細(xì)胞逃離視野
使活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)效率大幅提高的方法
在活細(xì)胞成像期間或結(jié)束后查看細(xì)胞的情況，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞從中途開(kāi)始衰弱、細(xì)胞死亡、細(xì)胞變?yōu)橐庀氩坏降臓顟B(tài)等現(xiàn)象。導(dǎo)致這些現(xiàn)象的原因可分為以下幾種。
熒光觀察時(shí)，激發(fā)光的波長(zhǎng)越短或光照越強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞造成的損傷也就越大。這就是所謂的“光毒性*1"，不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因受損而衰弱、死亡，還有可能會(huì)造成出乎意料的影響。
對(duì)策
請(qǐng)盡可能使用靈敏度高的相機(jī)
請(qǐng)并用增益*2 、Binning*3 等設(shè)定，即使較弱的熒光也能感知
請(qǐng)盡量調(diào)弱激發(fā)光
進(jìn)行拍攝設(shè)定時(shí)也請(qǐng)盡量避免照射激發(fā)光
請(qǐng)盡可能減少要拍攝的張數(shù)
不進(jìn)行拍攝時(shí)請(qǐng)切斷激發(fā)光
*1：光毒性：通常指照射的光造成的損傷，但是在熒光觀察時(shí)，指細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧使周圍的細(xì)胞遭受損傷。
*2：增益：對(duì)相機(jī)接收的信號(hào)進(jìn)行放大。放大程度越高（調(diào)高增益），顯示的畫面越明亮。雖然像素?cái)?shù)不會(huì)變，但是會(huì)產(chǎn)生噪點(diǎn)。
*3：Binning：虛擬地結(jié)合周圍的像素，放大單位像素接收的光信號(hào)的功能。噪點(diǎn)較調(diào)高增益時(shí)更少，但是像素?cái)?shù)會(huì)減少。
多數(shù)細(xì)胞都喜歡與生物體內(nèi)相同的環(huán)境。以人類細(xì)胞為例，在培養(yǎng)室及培養(yǎng)用恒溫箱中，基本上都需要滿足溫度37℃、二氧化碳濃度5%、濕度95%以上的條件。如果沒(méi)有穩(wěn)定供給這一條件，細(xì)胞就會(huì)衰弱，很難獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。
對(duì)策
請(qǐng)使用可以穩(wěn)定提供適合環(huán)境（溫度、二氧化碳濃度、濕度）的培養(yǎng)室及恒溫箱
在室溫變化大的季節(jié)，請(qǐng)使用空調(diào)等保持室溫穩(wěn)定
請(qǐng)避免空調(diào)等的風(fēng)直接吹到樣品。
使用多孔培養(yǎng)板時(shí)，請(qǐng)使用水分不會(huì)蒸發(fā)的型號(hào)
有的細(xì)胞容易受容器上附著的菌、污染物的影響。此外，移液管等實(shí)驗(yàn)用器械可能也會(huì)導(dǎo)致支原體污染*4、交叉培養(yǎng)污染 *5。
對(duì)策
實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)確保使用的容器、移液管等周邊用品設(shè)備均為無(wú)菌狀態(tài)
請(qǐng)盡量避免攜帶細(xì)胞移動(dòng)
*4：支原體污染：由支原體引起的感染。在細(xì)胞株被污染的眾多原因中，是極為普遍的現(xiàn)象之一。
*5：交叉培養(yǎng)污染：正在操作中的細(xì)胞混入其他細(xì)胞。多為器械原因混入。
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耗時(shí)許久的實(shí)驗(yàn)終于結(jié)束，一看得到的數(shù)據(jù)，卻發(fā)現(xiàn)焦點(diǎn)從中途就模糊了。這種現(xiàn)象是較多的失敗事例之一。許多研究者都經(jīng)歷過(guò)這種失敗，但只要理解其中的原因，其實(shí)是可以主動(dòng)避免的。
如果在接通裝置電源后馬上進(jìn)行拍攝設(shè)定，焦點(diǎn)在設(shè)定期間可能就會(huì)發(fā)生偏移。這是因?yàn)榻油娫春蟮囊欢螘r(shí)間內(nèi)，容器內(nèi)的培養(yǎng)液會(huì)發(fā)生對(duì)流，細(xì)胞也會(huì)移動(dòng)。觀察設(shè)備等也會(huì)因溫度變化而出現(xiàn)一定的膨脹現(xiàn)象，使焦點(diǎn)發(fā)生偏移。在觀察漂浮細(xì)胞、粘附細(xì)胞時(shí)，都需要注意拍攝設(shè)定中與拍攝中的溫度偏差。
對(duì)策
請(qǐng)?jiān)诜胖眉?xì)胞前用空容器暖機(jī)運(yùn)行30分鐘，
暖機(jī)運(yùn)行后放置細(xì)胞，在設(shè)定焦點(diǎn)等之前還要等待30至60分鐘
*7：溫度漂移：溫度變化導(dǎo)致漂浮的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象、因裝置自身的膨脹使對(duì)焦位置錯(cuò)開(kāi)的現(xiàn)象。
活著的細(xì)胞在分裂時(shí)尤其會(huì)朝上下方向（Z方向）運(yùn)動(dòng)。因此，如果在分裂的瞬間用高倍率進(jìn)行單次自動(dòng)對(duì)焦拍攝，焦點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移。
對(duì)策
請(qǐng)使用景深*8大的低倍鏡頭
如果是高倍率，請(qǐng)使用自動(dòng)對(duì)焦功能或Z棧功能
在活細(xì)胞成像中采取上述預(yù)防措施，可切實(shí)防止焦點(diǎn)偏移。此時(shí)，為了盡量縮短照射激發(fā)光的時(shí)間，盡量縮小自動(dòng)對(duì)焦及Z棧的設(shè)定范圍*9也是非常關(guān)鍵的。
*8：景深：表示對(duì)焦的范圍。一般NA越高景深越淺。
*9：Z棧的設(shè)定范圍：Z棧是對(duì)不同的Z位置數(shù)據(jù)進(jìn)行多張拍攝的功能。拍攝范圍越大移動(dòng)步徑越小，可獲得的信息越多，但是細(xì)胞的損傷也相應(yīng)地增加，因此希望以盡可能少的張數(shù)進(jìn)行設(shè)定。
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實(shí)驗(yàn)后觀看數(shù)據(jù)時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已經(jīng)中途移到了視野范圍外。要是細(xì)胞在目標(biāo)現(xiàn)象尚未完成時(shí)發(fā)生了移動(dòng)，就只能重做實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞逃離視野范圍的可能性越高。只要細(xì)胞是活著的，就無(wú)法避免這一問(wèn)題。相信大家都在各類論文中讀到過(guò)觀察細(xì)胞細(xì)節(jié)的數(shù)據(jù)。其中的絕大多數(shù)，都是通過(guò)高倍率反復(fù)進(jìn)行多次拍攝后獲得的結(jié)果，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力。
要切實(shí)避免失敗，較好的方法就是一次性拍攝多點(diǎn)，或者是讓視野追隨移動(dòng)的細(xì)胞進(jìn)行拍攝。
對(duì)策
請(qǐng)用倍率低的鏡頭拍攝大的視野
請(qǐng)一次拍攝多個(gè)部位
低倍率觀察時(shí)視野較大，細(xì)胞不易逃離視野，可切實(shí)捕捉細(xì)胞。但使用低倍率，卻無(wú)法觀察細(xì)胞的細(xì)節(jié)。曝光時(shí)間也會(huì)變長(zhǎng)，如觀察對(duì)象在拍攝期間運(yùn)動(dòng)，圖像也可能會(huì)發(fā)生抖動(dòng)*10，故請(qǐng)注意。
*10：曝光時(shí)間和圖像抖動(dòng)：調(diào)弱激發(fā)光，曝光時(shí)間自然變長(zhǎng)。如果在打開(kāi)快門期間細(xì)胞動(dòng)了，圖像就會(huì)抖動(dòng)。要防止這種現(xiàn)象，使用高靈敏度的相機(jī)是一種有效的辦法。
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一直以來(lái)，要獲得更好的研究成果，就必須重復(fù)進(jìn)行更多次的實(shí)驗(yàn)，獲取更多的信息。但是活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的單次耗時(shí)很長(zhǎng)，多次重復(fù)會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間。特別理想的狀態(tài)，就是能夠在單次實(shí)驗(yàn)中獲取盡可能多的信息。
基恩士的一體化熒光顯微成像系統(tǒng)“BZ-X800系列"，能夠解決活細(xì)胞成像“單次實(shí)驗(yàn)可獲得的信息量"問(wèn)題。可一次性獲取2倍、4倍、20倍等不同條件下最多999個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)。設(shè)定操作也很簡(jiǎn)單，可縮短過(guò)去用于系統(tǒng)準(zhǔn)備及使用者培訓(xùn)的時(shí)間。
熒光顯微成像系統(tǒng) 產(chǎn)品目錄
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