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一直被模仿，从未被超越丨Agilent MHC 2D-LC /MS 液质联用技术专题 2 - 多肽和寡核苷酸药学研究
上期我们一同回顾了 Agilent MHC 2D-LC 发展历史及深入的技术介绍，并分享了 MHC 2D-LC/6230 TOF 液质联用系统在蛋白领域的应用成果，本期将聚焦于多肽（Peptide）和寡核苷酸（Oligo）药学研究领域的应用。
图 1. Agilent MHC 2D-LC/TOF 示意图
在多肽和寡核苷酸的药学研究工作中，有关物质分析鉴定和 QC 方法建立是行业共识的难题。由于杂质和 API 的性质极为相似，以及“差向肽”或寡核苷酸硫代造成的非对映异构体杂质等，单一的液相色谱方法往往会存在杂质和主峰共洗脱或者分离度低的问题，因此通常需要借助互补的检测技术如 LC-UV-MS 联用以及多个正交的液相色谱方法来进行有关物质的控制。主峰峰纯度确认和杂质分析鉴定是 Peptide和Oligo 药物 QC 工作的基础。
HiRes 进行主峰纯度确认
国家药监局药品审评中心发布的《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》1 中提出使用液质联用方法对多肽主峰纯度进行研究，以及使用正交方法进行有关物质分析。为了有效分离检测到 0.1% 的低含量杂质，往往需要增大 API 进样量（大于 0.5 mg/mL），这样会造成主峰过载，从而大大降低杂质峰与主峰的分离度，造成无法对杂质峰进行准确定量或者质谱离子化抑制的问题。
解决办法就是使用 HiRes 模式（图 2）：将主峰连续切割为 10 片依次进入第二维色谱进行分析，相当于把主峰的浓度降低了 10 倍，解决了主峰“掩盖”杂质峰的问题。如果在第二维应用正交方法，还可以将差向异构肽等有关物质实现分离和分别定量。
图 2. 对目标峰的连续存储的 HiRes 模式
ASM 进行一维质谱不兼容体系的杂质鉴定
与蛋白不同，Peptide 和 Oligo 一维分离时会用到有机溶剂或高盐体系，当切割的组分含有机相或高盐时，会在二维上保留变差甚至没有保留，导致质谱信号降低；特别是 Oligo，当使用 2D-LC/MS 对 Oligo 阴离子交换分离（会用到高浓度 NaCl 或 NaClO4 质谱不兼容的盐）的色谱峰进行质谱鉴定时，一维组分中的高浓度的盐会影响 Oligo 在二维反相离子对的保留，在此推荐使用 ASM（图 3）功能可降低二维上样时的盐浓度，保证一维组分能在二维上有保留进而实现质谱鉴定。
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图 3. ASM 管路为 1uL 的分流比 4:1
Agilent MHC 2D-LC/Q-TOF
大分子表征的应用案例-Peptide
MHC 应用案例
司美格鲁肽杂质鉴定
一维分离：Infinity II 1260 生物惰性液相色谱（四元），配备 VWD 检测器
反相分离，A 相：0.088M 磷酸二氢铵溶液（pH 3.6）：乙腈=9：1（V：V，pH 3.8±0.1），B相：乙腈
二维分离：Infinity II 1290 超高效液相色谱系统（二元），质谱兼容的反相体系
质谱：6545XT AdvanceBio Q-TOF
数据采集及处理软件：Masshunter 及 BioConfirm 12.1
实验结果
对司美格鲁肽主峰前后的 10 个杂质进行质谱鉴定，其中 Cut6 的一级分子量比主成分多 106Da，结合文献并使用 BioConfirm12.1 软件自定义编辑修饰进行匹配，鉴定结果显示该修饰发生在 25 位上的色氨酸（Trp）上（红色方框所示）发生羟基苄基化修饰，其 y6 离子与主成分一致，而 y7、y8 以及 y9 等均比主成分多 106Da，进一步说明修饰发生在 25 位-Trp上。
图 4. 司美格鲁肽杂质鉴定的一级质谱图以及杂质（25 色氨酸-羟基苄基化修饰）二级质谱匹配图
HiRes MHC 应用案例
司美格鲁肽主峰纯度研究
一维分离：Infinity II 1260 生物惰性液相色谱（四元），配备 VWD 检测器
反相分离，A 相：0.088M 磷酸二氢铵溶液（pH 3.6），乙腈=9：1（V：V，pH 3.8±0.1）；B相：乙腈
二维分离：Infinity II 1290 二元超高效系统，质谱兼容的反相体系
质谱：6545XT AdvanceBio Q-TOF
数据采集及处理软件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
实验结果
1 针进样，使用 HiRes 对司美格鲁肽主峰进行连续 10 片切割（从色谱峰的起始至结束）。该 10 片组分依次通过第二维色谱系统洗脱至质谱进行检测。以 cut1 为例，cut1 中包含比主峰小 101Da 的杂质，通过解卷积后的质谱含量为 75%（主峰解卷积响应/（主峰解卷积响应+杂质解卷积响应））。综合所有 10 个 cuts 的质谱数据，得出主峰的质谱纯度为 99.72%。
图 5. HiRes 应用案例 司美格鲁肽主峰纯度分析的色谱图以及质谱纯度结果
Agilent MHC 2D-LC/6230 TOF
大分子表征的应用案例-Oligo
MHC 配备 ASM 应用案例
Oligo 阴离子交换色谱峰的质谱鉴定
一维分离：Infinity II 1260 生物惰性液相色谱（四元），配备 VWD 检测器
离子交换分离，A 相：20mM Tris-HCl（pH 8.5），B 相：1M NaClO4 溶解在 A 相
二维分离：Infinity II 1290 二元超高效系统，质谱兼容的反相体系，使用 ASM 功能降低上样时的盐浓度，保证 oligo 在二维反相离子对体系的保留，实现质谱鉴定
质谱：Agilent 6230 TOF
数据采集及处理软件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
实验结果
使用带有 ASM 功能的 MHC 系统，1 针进样对 Oligo 样品主峰前后 9 个不同时间段进行鉴定，如图所示 cut1 和 cut2 的解卷积后分子量差值为 535.1Da，可根据序列信息进一步推测杂质类型。
图 6. Oligo 杂质分析的色谱结果以及部分解卷积结果
Agilent MHC 2D-LC /MS 系统将会不断完善和创新，持续助力 Peptide 和 Oligo 等药物研发进程。
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独特的 MHC 切割组件结合 Masshunter 软件，在 MHC 模式下实现最多 11 个峰的智能存储并通过二维洗脱并进行质谱鉴定，节约样品，提高分析通量；
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独特的 MHC 切割组件结合 Masshunter 软件，在 HiRes 模式对 Peptide 或 Oligo 等进行主峰纯度评估，将包含在主峰中的杂质或通过二维分离开进行质谱鉴定或通过降低主峰的信号抑制而实现质谱鉴定；
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MHC 组件中的 ASM 功能，可降低二维分离时的溶剂效应或盐效应，保证目标峰在二维的保留，有助于提高质谱响应用于质谱鉴定。
参考文献：
1. 国家药监局药审中心，化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行），2023 年 2 月