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說一說熒光素酶的作用原理
閱讀：2457 發(fā)布時間：2022-4-20
熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在熒光素氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光。然后可以通過熒光測定儀測定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以靈敏、高效地檢測基因的表達，是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。
目前，具有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Fireflyluciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renillaluciferase）。其中螢火蟲熒光素酶作為報告基因反應(yīng)目的基因表達的改變，腎熒光素酶作為內(nèi)參基因，為實驗提供統(tǒng)一基準線（減少內(nèi)在變化因素如培養(yǎng)細胞的數(shù)目，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率對實驗準確性的影響）。
螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時產(chǎn)生黃綠色光，波長540-600nm。
腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產(chǎn)生藍光，波長460-540nm，一般檢測時選用460nm
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞，適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。
由于兩種酶底物和發(fā)光顏色的區(qū)別，且在動物體內(nèi)無內(nèi)源性表達，使其雙報告基因系統(tǒng)在基因調(diào)控、非編碼RNA靶向互作等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。