Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins

利用Cas9核糖核酸蛋白在工業(yè)微藻中實(shí)現(xiàn)高效無轉(zhuǎn)基因靶向誘變和單鏈寡脫氧核苷酸介導(dǎo)的精確敲入

2019 年 5 月 26 日，在Plant Biotechnology Journal 雜志發(fā)表了一篇論文" Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins  "，文章中將CRISPR/ Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)應(yīng)用于纖細(xì)裸藻中，為闡明其他微藻類的基因功能提供了一個(gè)突破。

纖細(xì)裸藻是一種單細(xì)胞光合鞭毛蟲，也是一種工業(yè)開發(fā)的微藻，它富含營養(yǎng)元素，積累大量的裸藻淀粉，具有多種生物活性功能。因此，大量培養(yǎng)的纖細(xì)裸藻是功能性食品、飼料和化妝品的商業(yè)來源。此外，在厭氧條件下，裸藻淀粉可被降解并轉(zhuǎn)化為主要由肉豆蔻酸和肉豆蔻醇組成的蠟酯。由于纖細(xì)裸藻產(chǎn)生的蠟酯很容易轉(zhuǎn)化為具有低冰點(diǎn)的生物燃料，因此它適合作為生物噴氣燃料的來源。

纖細(xì)裸藻（又名小眼蟲，Euglena  gracils）

在文章中，研究者為了在纖細(xì)裸藻中建立了一種基于Cas9核糖核酸蛋白（RNPs）的無轉(zhuǎn)基因誘變方法，在纖細(xì)裸藻葡聚糖合成酶2（EgGSL2）基因的第二個(gè)外顯子內(nèi)設(shè)計(jì)了兩個(gè)靶序列，他們推測該基因可能參與了裸藻淀粉的生物合成。使用NEPA GENE電轉(zhuǎn)儀將Cas9核糖核酸蛋白導(dǎo)入到纖細(xì)裸藻細(xì)胞中（圖1b）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這兩種以EgGSL2為靶點(diǎn)的RNPs可以使纖細(xì)裸藻細(xì)胞表現(xiàn)出更少但更大的裸澡淀粉顆粒。靶1和靶2表型改變的平均頻率分別為71.3%和80.6%(圖1d)，并且在電穿孔后72h檢測，插入缺失突變率分別為77.7-86.8%和88.8-90.1%（圖1g）。

纖細(xì)裸藻作為一種可再生資源具有很多優(yōu)異特性，但想要建立其有效靶向誘變一直是一個(gè)長期的挑戰(zhàn)。在這里，研究者利用CAS9 RNPS開發(fā)了一種高效的無轉(zhuǎn)基因靶向誘變和單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的基因敲入，這將為纖細(xì)裸藻是一種可編輯基因組的有機(jī)體提供了第一個(gè)證據(jù)，利用裸藻中所含的副淀粉和脂肪酸合成了生物塑料，為纖細(xì)裸藻開發(fā)應(yīng)用開拓了新方向，同時(shí)促進(jìn)生物材料生產(chǎn)的可持續(xù)性發(fā)展。

文章采用的是NEPA21 電轉(zhuǎn)染儀來進(jìn)行電轉(zhuǎn)，采用全新的四步法電轉(zhuǎn)程序，配合多脈沖、電壓衰減（Voltage Decay）和輔助基因?qū)肽Ｊ皆O(shè)計(jì)，可在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，提高細(xì)胞存活率 ，并且不需要特殊轉(zhuǎn)染試劑輔助。