激光共聚焦显微镜的原理是用点光源照射试样，在焦平面上形成轮廓清晰的小光斑。光斑照射后发出的荧光被物镜收集，沿原照射光路送回由双向色镜组成的分光镜。光谱仪将荧光直接发送到检测器。光源和探测器前面有一个针孔，分别称为照明针孔和检测针孔。两者的几何尺寸相同，约100-200纳米；与焦平面上的光斑相比，两者是共轭的，即光斑可以通过一系列透镜同时聚焦在照明针孔和检测针孔上。这样，来自焦平面的光可以会聚在检测孔范围内，而来自焦平面上方或下方的散射光被阻挡在检测孔之外而无法成像。激光逐点扫描样本，检测到针孔后的光电倍增管也逐点获得相应光点的共焦图像，将其转化为数字信号传输至计算机。整个焦平面的清晰共焦图像聚集在屏幕上。

　　每个焦平面图像实际上是样品的光学横截面，这种光学截面总是具有一定的厚度，也称为光学片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，且非焦平面光被针孔过滤，因此共焦系统的景深近似为零。沿z轴扫描可实现光学断层扫描，并在待观察样品的焦斑处形成二维光学切片。将X-Y平面（焦平面）扫描与z轴（光轴）扫描相结合，将连续层次的二维图像进行累加，经专用计算机软件处理，即可得到样品的三维图像。即检测针孔和光源针孔始终聚焦在同一点上，使得聚焦平面外激发的荧光无法进入检测针孔。