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凍存管的使用是一門學(xué)問(wèn)，并不是打開液氮罐、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡(jiǎn)單的三部曲可以完成的?？茖W(xué)正確地使用凍存管，可以避免樣本的損失，并保護(hù)試驗(yàn)人員的安全。

凍存管：冷凍步驟

用預(yù)熱的PBS溶液洗滌細(xì)胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細(xì)胞（薄薄的液層足夠，胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據(jù)細(xì)胞系確定）。

37℃孵育細(xì)胞3-5分鐘。

細(xì)胞從底部脫離之后，終止孵育，加入含有血清的培養(yǎng)基，用移液器輕輕地懸浮細(xì)胞。

離心細(xì)胞懸液（500 x g, 5分鐘），用含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮。

細(xì)胞計(jì)數(shù)。

離心細(xì)胞懸液（500 x g, 5分鐘），去除上清液，用適量體積的含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。

以1:1體積比混合細(xì)胞和凍存液（60%培養(yǎng)基，20%胎牛血清，20% DMSO），然后轉(zhuǎn)移到Cryo.sTM凍存管中。凍存的細(xì)胞密度為 1-5×106 個(gè)/毫升。

含有細(xì)胞的Cryo.sTM凍存管建議以−1 K / min 的速率降溫，可以將凍存管置于−70℃含有異丙醇的容器中。如果Cryo.sTM凍存管存儲(chǔ)其他樣品，可以直接放置在−20℃，−70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻，4 mL和5 mL的Cryo.sTM凍存管需要先置于在−20℃冰箱過(guò)夜，然后再轉(zhuǎn)移到−70℃或者液氮的氣相。

然后轉(zhuǎn)移Cryo.sTM凍存管到液氮罐。為了避免污染（如支原體）和安全考慮，請(qǐng)將Cryo.sTM凍存管置于液氮的氣相，切勿置于液相。