說(shuō)到外泌體的純度，想必讓很多該領(lǐng)域的從業(yè)者也比較頭疼。外泌體主要由各類(lèi)細(xì)胞分泌，存在于各種體液中，由于形成環(huán)境的復(fù)雜性，再加上外泌體在體液里含量不高，導(dǎo)致其存在天然的提取難度，往往費(fèi)盡力氣提取到的樣品，里面的物質(zhì)有多少是真正的外泌體還很難說(shuō)，現(xiàn)有方法如WB、電鏡等常見(jiàn)的檢測(cè)手段雖然能夠在一定程度上對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定，但都存在各自的局限，WB雖然能夠檢測(cè)外泌體的標(biāo)志性蛋白，但耗時(shí)長(zhǎng)，也分辨不了游離的蛋白；電鏡可以直觀(guān)的看見(jiàn)外泌體，但實(shí)在缺乏統(tǒng)計(jì)性，而且設(shè)備過(guò)于昂貴，制樣復(fù)雜，這些都無(wú)疑加大了外泌體的研究難度。
不過(guò)我們可以將多種方法結(jié)合使用，互相驗(yàn)證，以此來(lái)確定外泌體的純度信息，本篇我們將用BCA和Triton（曲拉通）X-100結(jié)合瑞芯智造的納米庫(kù)爾特粒度儀（Nanocoulter）對(duì)外泌體的純度進(jìn)行鑒定。
我們將A和B兩種不同的外泌體樣品進(jìn)行相同倍數(shù)的稀釋?zhuān)扔脤?duì)蛋白耐受性較低的芯片測(cè)試，結(jié)果顯示A樣品可以正常測(cè)試，但B樣品測(cè)試過(guò)程中出現(xiàn)異常，我們由此初步判斷A樣品蛋白濃度低于B樣品；然后再用蛋白高耐受芯片重復(fù)測(cè)試，得到A、B兩種樣品的顆粒濃度，并通過(guò)BCA測(cè)定兩種樣品的蛋白含量，以顆粒濃度值/蛋白濃度值來(lái)反映外泌體樣品的純度（如下圖所示。）。
圖1：納米庫(kù)爾特粒度儀（瑞芯智造）用不同耐受性芯片測(cè)試外泌體
這種采用與BCA蛋白濃度測(cè)試結(jié)合的方法能夠?qū)悠窛舛冗M(jìn)行快速檢測(cè)，可以在一定程度上反映外泌體樣品的純度，但這種方法精確度不是很高，因?yàn)锽CA檢測(cè)到的外泌體樣品中的蛋白含量跟真正的外泌體膜蛋白的含量是存在差異的，在樣品中游離的非膜蛋白也會(huì)被檢測(cè)到，所以實(shí)際檢測(cè)到的蛋白濃度比起真正外泌體膜蛋白濃度是要偏高的，該方法適用于采用相同手段獲得的外泌體樣品純度的快速對(duì)比檢驗(yàn)。
Triton（曲拉通）X-100是一種非離子表面活性劑，低濃度可以增加細(xì)胞膜通透性，高濃度可以裂解細(xì)胞，而外泌體的膜結(jié)構(gòu)與細(xì)胞別無(wú)二致，所以可以用TritonX-100裂解外泌體，通過(guò)檢測(cè)裂解前后的樣品顆粒濃度變化來(lái)鑒定其純度。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下；將一外泌體樣本稀釋100倍后分成等量的兩份，將其中一份加入一定比例（須確保能夠裂解所有外泌體）的TritonX-100試劑，然后將兩份樣品在相同條件下充分混勻以全部裂解外泌體，之后同時(shí)開(kāi)始測(cè)試，最終結(jié)果
如下圖所示：
圖2：納米庫(kù)爾特粒度儀（瑞芯智造）測(cè)試TritonX-100裂解外泌體前后濃度變化
從上面的數(shù)據(jù)中可以看出破膜前后樣品濃度發(fā)生了將近10倍的變化，但是粒徑的分布情況卻比較類(lèi)似，說(shuō)明其實(shí)樣品里面非外泌體顆粒和真正的外泌體粒徑分布很接近，通常采用離心分離或者尺寸排阻類(lèi)方法提取外泌體會(huì)比較容易出現(xiàn)這種情況，最后計(jì)算得出該樣品的純度為87.2%，該方法操作簡(jiǎn)單、精確度高、檢測(cè)速度快，是一種不錯(cuò)的外泌體純度檢驗(yàn)方法。
納米庫(kù)爾特粒度儀應(yīng)用的RPS原理又稱(chēng)電阻感應(yīng)脈沖法，電解質(zhì)溶液中的顆粒通過(guò)納米孔時(shí)，在恒電流設(shè)計(jì)的電路中，導(dǎo)致電極間電阻產(chǎn)生瞬時(shí)變化從而產(chǎn)生電脈沖，電脈沖幅度與粒徑成正比。作為電學(xué)檢測(cè)原理方法，RPS 不同于光學(xué)檢測(cè)方法,如動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、納米粒子示蹤(NTA)、納米流式，與樣本光學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)。納米庫(kù)爾特粒度儀可在單顆粒水平實(shí)現(xiàn)納米顆粒的多參數(shù)表征，粒徑測(cè)量精度可媲美電鏡，3-5min就可精準(zhǔn)得到樣品完整，真實(shí)的粒徑分布。
得益于納米庫(kù)爾特粒度儀的高精度、高分辨率和檢測(cè)速度，我們能夠通過(guò)這兩種簡(jiǎn)便快速的方法測(cè)試外泌體的純度，為這個(gè)難題提供了行之有效的解決辦法，當(dāng)然，瑞芯智造仍會(huì)致力于打造檢測(cè)更精確、應(yīng)用更全面的納米粒度儀，我們還會(huì)不斷探索研究，以期能做到更優(yōu)更好，希望能為外泌體領(lǐng)域的研究發(fā)展提供更強(qiáng)的助力。
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