PriCells: 原代细胞培养后过氧化物酶检测
PriCells: 原代细胞培养后过氧化物酶检测
试剂和器材:
1. 过氧化物储存液:30mmol/L过氧化氢储存在T-牛血清白蛋白(Tris-牛血清白蛋白溶液)中;
2. 样品缓冲液:2体积的T-牛血清白蛋白溶液+1体积的2%(体积分数)Triton X-100;
3. 钛氧硫化物(2.25g/L)溶于1mol/L硫酸中;
4. T-牛血清白蛋白:20mmol/L的Tris-HCl(pH7.0),含1g/L牛血清白蛋白;
5. 微量离心机,带2.0ml微量离心管;
6. 分光光度计;
实验方法:
原代细胞培养后,所有操作都在2ml微量离心管中,置于冰上进行,所有溶液也保持在冰浴环境下。
1. 新鲜制备待测混合物,将8.5ml过氧化物储存液用T-牛血清白蛋白溶液稀释至100ml;
2. 向0.5ml测定混合物中加入1.0ml钛氧硫化物,在405nm波长下测定吸光度,应该约为1.5.如果不是,就相应地调整过氧化氢的浓度;
3. 将10μl样品与30μl样品缓冲液相混合,反应对照液使用40μl样品缓冲液;
4. 所有管子中都加入0.5ml待测混合物,每批只操作6管;
5. 准确计时1min后,加入1.0ml的钛氧硫化合物,用微量离心机以13500g离心2min;
6. 所有管都在室温达到平衡后在405nm波长处测量吸光度,空白样含有0.54ml T-牛血清白蛋白和1ml钛氧硫化合物;