PriCells: 碘克沙醇梯度提取哺乳动物原代细胞过氧化物酶体                                           

试剂和器材： 
1. OptiPrepTM（600g/L的碘克沙醇）；
2. 匀浆介质：0.25mmol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、1g/L乙醇、5mmol/L 3-吗啉基丙磺酸（MOPS），pH7.2；
3. 稀释剂：6mmol/L乙二胺四乙酸、6g/L乙醇、30mmol/L MOPS，pH7.2；
4. 1mol/L 蔗糖溶液；
5. 按要求向匀浆介质和稀释剂中加入蛋白酶抑制剂；
6. 使用匀浆介质制备好的线粒体组分；
7. Dounce匀浆器（10ml宽松配制，Wheaton B型）；
8. 两室梯度制备仪或Gradient MasterTM；
9. 5ml注射器（内径大约为0.8mm），带金属套管针；
10. 超速离心机，配有容纳30—40ml体积的固定角离心转子，最大转速大约为100000g，另带大约30ml容量的厚壁管；
11. 梯度收集器；

实验方法：
哺乳动物原代细胞培养。
原代细胞收集后，所有操作均在0—4℃进行。
1. 使用碘克沙醇、稀释剂、1mol/L蔗糖溶液和水分别根据不同的体积比配制一下梯度溶液：500g/L碘克沙醇（5+0.6+0.4+0.0）、400g/L碘克沙醇（4+0.6+0.7+0.7）和200g/L碘克沙醇（2+0.6+1.1+2.3）；
2. 使用宽松配制的Dounce匀浆器在匀浆介质中对线粒体沉淀进行重悬（研杵研磨2—3次），相应地调整使得每克组织对应0.5ml体积；
3. 使用两室梯度制备仪或者Gradient MasterTM来制备线性梯度，使用注射器和金属套管针从200g/L和400g/L的碘克沙醇溶液中各取9ml，制备梯度溶液并置于适用于固定角离心转子的聚碳酸酯管中，每个梯度最底层均为2ml的500g/L碘克沙醇；
4. 在每个梯度溶液上层加入3ml混悬液，然后在105000g下离心1h；
5. 让转子从1000r/min开始持续减速，将梯度溶液收集于1ml中，密度越大的可越先得到收集。或者也可以用注射器和金属套管针来收集沿梯度溶液往下2/3距离上形成带的过氧化物酶体；