PriCells: 原代细胞核孔复合物的分离                                                           

试剂和器材： 
1. 肝素；
2. 苯jia基磺酰氟（PMSF）（溶于乙醇中配制成1mol/L储存液）；
3. 纯化的核膜；
4. 提取缓冲液（EB）：含1%（体积分数）Triton X-100的10mmol/L Tris-HCl，（pH7.4）、0.1mmol/L苯jia基磺酰氟；
5. Tris缓冲液：2mmol/L Tris-HCl、pH7.4，10mmol/L Tris-HCl、pH7.4；
6. 梯度溶液：0.25mol/L蔗糖溶液和1.5mol/L蔗糖溶液溶于10mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
7. 所有溶液须含0.1mmol/L苯jia基磺酰氟；
8. 梯度收集器；
9. 高速离心机，配有固定角转子和离心管；
10. 超速离心机，配有固定角和吊桶式转子、离心管；
11. 超声发生器（探针型，带有定时器）；
12. 双室梯度仪或者Gradient MasterTM；

实验方法：
1. 采用提取缓冲液，4℃抽提原代细胞核膜30min；
2. 20000g离心30min，松散地沉淀核孔复合物薄片。用2mmol/L Tris-HCl、（pH7.4）小心重悬沉淀，再次离心；
3. 用10mmol/L的Tris-HCl（pH7.4）小体积重悬沉淀（如1ml），并在冰浴上超声处理。为防止样品产热，超声过程中重复短时间处理（如10s），中间间隔冷却；
4. 通过制备负染标本，如用20g/L钼酸铵（pH7.0）或50g/L钼酸铵-1g/L海藻糖（pH7.0）进行电镜分析，及时监测核膜的破裂以及核孔复合物的释放。如果必要的话，继续超声处理；
5. 将样品加于0.25—1.5mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCl（pH7.4）线性密度梯度溶液上，4℃、约60000g离心1—2h；
6. 从蔗糖梯度溶液中部分收集；
7. 采用负染电镜检测收集各成分内容物，以确定核孔复合物沉淀在蔗糖梯度溶液中的位置，并进行完整性分析；
8. 对梯度成分进行SDS-PAGE，检测蛋白分离情况；