PriCells: DPSCs/SHED的原代培养                                                              

Stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED)

Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs)

试剂和材料：
1. 无镁和钙的PBS平衡盐溶液（PBSA）；
2. MSC培养基：含2mmol/L 谷氨酰胺的α-MEM，添加15%胎牛血清，0.1mmol/L左旋抗坏血酸磷酸盐，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；
3. Ⅰ型胶原酶；
4. 中性蛋白酶；
5. 免疫磁珠分选时所需试剂；
（1） 含1%BSA的PBSA
（2） 与DPSC反应的一抗，用STRO-1（小鼠抗人MSC；IgM），CC9（小鼠抗人CD146/MUC-18；IgG2a），或3G5（小鼠抗人外膜细胞；IgM）
（3） 羊抗小鼠IgG-结合或大鼠抗小鼠IgM-结合磁珠
6. 培养瓶或培养皿；
7. 手术刀片和刀柄；
8. 70μm细胞滤网；
9. 回转式混合仪；
10. Dynal MPCR-1磁分离器

实验方法：
1. 用手术刀片将牙髓组织切成小碎片；
2. 将剪碎的组织放入胶原酶/中性蛋白酶混合溶液中（1：1）；
3. 37℃孵育30—60min，间歇地摇匀组织/消化酶混合物；
4. 消化后，加入足够的MSC培养基，终止酶的活性；
5. 将悬液经70μm细胞滤膜过滤，去除细胞碎片，得到单细胞悬液；
6. 500g离心6min；
7. 倒掉上清液，用MSC培养基重悬细胞。然后进行免疫磁珠分?。?br/>（1） 和能与DPSC细胞反应的一抗孵育，包括STRO-1（小鼠抗人MSC；IgM），CC9（小鼠抗人CD146/MUC-18；IgG2a），或3G5（小鼠抗人外膜细胞；IgM），20μg/ml，冰上孵育1h；
（2） 用含1%BSA的PBSA洗两遍，600g离心6min；
（3） 羊抗小鼠IgG-结合或大鼠抗小鼠IgM-结合磁珠的任意一个二抗孵育，4℃回转式混合仪40min；
（4） 根据产品说明书推荐的方案，通过Dynal MPCR-1磁分离器分离结合磁珠的细胞；
8. 细胞计数，按（1×10）×10³个细胞/cm²密度接种到培养瓶或皿上；
9. 在MSC培养基、37℃和5%CO_²的培养箱中培养；
10. 细胞分离后7天，用PBSA洗培养瓶，更换培养基。之后可以一周两次更换培养基，直至细胞达到汇合；