PriCells: 收集大鼠骨髓用于生产MSCs

试剂和材料：
1. *培养基（CCM）：α-MEM：α-*基础培养基，含谷氨酰胺，无核苷酸或脱氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经FBS杂交瘤纯化，非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。过滤除菌。储存于4℃，不超过2周；
2. 纱布；
3. 含100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和0.2μg/ml两性霉素B的PBSA；
4. 无镁和钙的Hank′s平衡盐溶液（HBSS）；
5. 塑料Petri培养皿，15cm直径；
6. 装有#10和#15刀片的解剖刀；
7. 1和2英尺刀刃的手术剪；
8. 镊子；
9. 止血钳；
10. 15cm刀刃的咬骨钳；
11. 带Luer接头的注射器，20ml；
12. 皮下注射针，23号和18号；
13. 微量离心管，1.5ml和0.5ml；
14. 聚丙烯离心管，15ml和50ml；
15. 成年Lewis大鼠；
16. CO_²啮齿动物安le死小室；
17. Eppendorf 5417C微量离心器或同等设备；

实验方法：
1. CO2窒息处死动物，切勿使用药物；
2. 用酒精擦拭后肢，在不破坏股骨的情况下解剖后肢。将股骨从肢体中分离出来；
3. 切除股骨上的肌肉和肌腱。用无菌纱布擦拭除去骨上的剩余组织；
4. 用酒精擦拭已清理干净的骨，将其放入50ml塑料管中；
5. 用含抗真菌药物的冰浴CCM浸没骨，直到骨髓提取准备完毕。从分离骨到骨髓提取的时间尽量缩短；
6. 装有股骨的离心管移至微生物安全橱中，将骨放入15cm petri培养皿中；
7. 按如下步骤提取骨髓；
（1） 用咬骨钳剪掉骨的两端，暴露内部骨髓；
（2） 装有23G针头的注射器中吸入5ml含抗真菌药物的CCM，向50ml离心管中冲洗每根股骨；
（3） 吸取冲洗后的CCM，反复冲洗股骨3次，将其转移至15ml离心管中；
（4） 1000g离心，用1ml含抗真菌药物的CCM重悬骨髓沉淀；
（5） 在15ml离心管中将1ml骨髓细胞悬液加入到4ml含抗生素和抗真菌药物的新鲜PBSA中。每根股骨所得的5ml细胞悬液可混合于同一个离心管中；
8. 在10℃ 1000g离心骨髓细胞10min，用10ml含抗生素和抗真菌药物的PBSA洗涤细胞3次；
9. 最后，用5ml CMM重悬骨髓细胞，置于冰上备用；