PriCells: 利用Hoechst 33342外流性质分选原代角膜间质干细胞

试剂和材料：
1. 2—4代的间质细胞；
2. HBSS/2FB；
3. Hoechst 33342染料，1mg/ml水溶；
4. 碘化丙啶（PI），2mg/ml水溶；
5. 维拉帕米，500μg/ml水溶；
6. DEME/2FB；
7. 胰蛋白酶/TrypLE：TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶，溶于CMF-Saline G；
8. MoFlo（或与其类似的）高速细胞分选仪，具备350nm激发能力；

实验方法：
1. 用PriCells原代细胞分离试剂盒2—4代的间质细胞；
2. 细胞计数，用DMEM/2FB将细胞稀释至1×10⁶/cm2个细胞/ml；
3. 加入5μg/ml Hoechst 33342染料，37℃，90min，每20min搅动一次；
4. 对照组细胞在加入Hoechst 33342染料前，先加入50μg/ml维拉帕米孵育20min；
5. 染色后，在4℃环境下用HBSS/2FB将细胞洗两遍并离心，之后在冰上用冷HBSS/2FB重悬细胞；
6. 于分选前加入2μg/ml PI以鉴别无活性的细胞；
7. 无菌条件下分选细胞，高速细胞分选仪，用350nm激发。收集蓝色（670nm）和红色（450nm）荧光均减弱的细胞。边群细胞通过上述步骤与死细胞和*被染料标记的细胞分离开并被收集起来。对照组要确保用维拉帕米先行孵育后使边群细胞消失；