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PriCells: 正常动物肠肥大细胞的培养
PriCells: 正常动物肠肥大细胞的培养
实验材料：
1. 正常动物的肠或者手术切除标本的正常肠组织；
2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；
3. TE液：Tyrode液加入2 mmol/L EDTA。Tyrode液含137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、0.36 mmol/L NaH2PO4、5.55 mmol/L 葡萄糖；
4. TEA液：TE液加入200mg/L氨苄青霉素、200mg/L庆大霉素和40mg/L甲硝唑；
5. TGMD液：Tyrode液加入0.1%明胶、1.23 mmol/L MgCl2和15mg/L DNA酶；
6. HA液：HEPES液补充0.25g/L不含脂肪酸的BSA。HEPES液含20 mmol/L HEPES、125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和0.5 mmol/L 葡萄糖；
7. HACM液HA液补充1 mmol/L CaCl2和1 mmol/L MgCl2；
8. 消化液a：用TE液配成，含有3g/L链霉蛋白酶和0.75g/L木瓜凝乳蛋白酶；
9. 消化液b：用TGMD液配成，含有1.5g/L胶原酶和0.15g/L弹性蛋白酶；
10. 1g/L 乙酰半胱氨酸溶液，用TE液配成；
11. Percoll溶液：不含酚红的RPMI1640，添加10%FBS、50μg/L SCF、25 mmol/L HEPES、100000 IU/L青霉素和100mg/L链霉素。pH7.2；
12. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊，止血钳，无菌消毒手术器械；
13. 离心管（15ml、50ml）
14. 网筛：300μm不锈钢网筛
实验方法：
1. 取正常动物肠组织10—40g，用4℃的TEA液中，用眼科剪分离粘膜下层与肌层。将粘膜层和粘膜层切成1cm2的小块，放入乙酰半胱氨酸溶液中，室温下浸泡10min，除去粘液。将组织块放入含5mmol/L EDTA的TEA液中，然后在培养箱内放置15min，除去上皮细胞；
2. 用TE液充分冲洗组织块，然后将组织块剪碎，放入消化液a中，室温下消化30min。用孔径为300μm不锈钢筛网滤去已脱落下来的细胞。用TE液清洗，然后用消化液a将组织块重复消化1次；
3. 将组织块用TGMD液清洗后，放入消化液b中，在30℃条件下消化30min。用孔径为300μm不锈钢筛网滤出组织块，收集滤液，在4℃条件下离心（400g，10min）。吸去上清液，用HA液混悬沉淀细胞，在4℃条件下保存；
4. 按操作步骤3重新操作1次，得到细胞悬液；
5. 将操作步骤3和4收集的细胞悬液混合，用孔径为100μm不锈钢筛网过滤，收集滤液，在4℃条件下离心（400g，10min）。用HACM液混悬细胞，调整细胞密度至0.5×106—2×106个/ml；
6. 在50ml离心管中加入浓度为1.037g/ml的Percoll溶液20ml，将细胞悬液加于Percoll溶液表面上，然后在20℃条件下离心（400g，10min）。用HA液混悬沉淀细胞，在4℃条件下离心（400g，10min），然后重复离心1次；
7. 用培养液混悬沉淀细胞，调整细胞密度至0.5×106—2×106个/ml，放37℃、5%CO2的培养箱中培养。24h后换液，以后每周换液1次；
PriCells提供：
1. 各种原代细胞特制基础培养基；
2. 各种原代细胞培养特制添加剂；
3. 原代细胞分离试剂盒；
4. 原代细胞鉴定试剂盒；
5. 各种原代细胞DNA；
6. 各种原代细胞RNA；
7. 各种原代细胞蛋白质；