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磁珠分选柱手工操作分离小鼠CD4+CD25+抑制性细胞
PriCells: 磁珠分选柱手工操作分离小鼠CD4+ CD25+抑制性细胞
实验材料：
1. 小鼠
2. HBSS洗涤缓冲液
3. MACS缓冲液
4. CD8a（Ly-2）磁珠
5. 结合缓冲液
6. biotin-抗CD25（7D4）
7. Streptavidin-PE
8. 抗PE磁珠
9. *RPMI培养基
10. 小鼠CD3+T细胞富集柱和1×纯化柱缓冲液
11. 15ml离心管，无菌
12. autoMACS系统和分选柱
13. 30mm尼龙网或40mm预分离滤膜
14. 不含气体的MACS缓冲液，4℃（在上样和洗柱过程中保持冰冷）
15. Midi MACS分离磁铁
16. MACS多用支架
17. LD分选柱
18. 15ml离心管，无菌
19. LS分选柱
实验方法：
1. 用20只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液并去除红细胞。
2. 将细胞在20mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。
3. 将细胞悬液在4℃，200g离心10min。离心过程中，准备3支小鼠CD3+T细胞纯化柱，按说明书的指导用1×纯化柱缓冲液洗3遍。弃洗脱液，在每支纯化柱下方放置一支15ml离心管。
4. 用3ml 1×纯化柱缓冲液和3ml HBSS洗涤缓冲液混悬细胞。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜后，每支纯化柱中加入2ml细胞。室温孵育15min。
5. 用2ml 1×纯化柱缓冲液洗涤纯化柱4或5遍以洗脱T细胞。用血细胞计数器计数后，将细胞悬液在4℃，200g离心10min。
6. 将沉淀按每108个细胞加0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每108个细胞加入0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后4℃孵育15min。
7. 4℃，200g离心10min。
8. 按前述方法制备单细胞悬液，纯化T细胞并加入CD8a（Ly-2）磁珠。
9. 将Midi MACS分离磁铁安装到MACS多用支架上，并将LD分选柱放到磁铁中，每次用3ml 4℃不含气体的MACS缓冲液冲洗分选柱共3次。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支新的无菌15ml离心管。
10. 离心结束后弃上清，将沉淀用108个细胞/ml的MACS缓冲液*混悬。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。用0.1-0.4ml MACS缓冲液冲洗滤网。
11. 将细胞悬液上样到LD分选柱上。
12. 用MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml，共3次。第一个3ml应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞（CD4+ 细胞）保存。
13. 将细胞悬液在4℃，200g离心10min。
14. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到108个细胞/ml。每108个细胞加入15mg biotin-抗CD25（7D4）。4℃孵育15min。4℃，200g离心10min。
15. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到108个细胞/ml。每108个细胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。
16. 4℃，200g离心10min.
17. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到108个细胞/ml。每108个细胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。
18. 4℃，200g离心10min。
19. 按前述方案用结合缓冲液混悬细胞后加入biotin-抗CD25、Streptavidin-PE，以及抗PE磁珠。
20. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到108个细胞/ml。
21. 将一支LS分选柱放在Midi MACS分离磁铁上，用MACS缓冲液每次3ml洗3遍LS柱。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支新的15ml离心管。
22. 离心结束后弃上清，将沉淀用MACS缓冲液*混悬使细胞浓度达到108个细胞/ml。
23. 将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。用0.1-0.4ml MACS缓冲液冲洗滤网。
24. 将细胞悬液加到LS柱上。
25. 用MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml，共3次。第一个3ml应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞（CD4+ CD25-细胞）保存。
26. 将分选柱从磁铁上取下。在分离柱中加入5ml MACS缓冲液。将活塞塞进分离柱并洗脱阳性细胞（CD4+ CD25+细胞）。
27. 将细胞在4℃，200g离心10min。将CD25+细胞用1-2ml RPMI*培养基混悬。将CD25-细胞用10ml RPMI*培养基混悬。计数。