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PriCells: 磁珠法分离小鼠T细胞和B细胞
PriCells: 磁珠法分离小鼠T细胞和B细胞
基本方案
用AUTOMACS系统进行总T细胞、CD4+细胞或CD8+T细胞的自动分离
实验材料
1、小鼠
2、HBSS洗涤缓冲液
3、MACS缓冲液
4、磁珠
5、RPMI-10*培养基
6、AUTOMACS系统和分选柱
7、30μm尼龙网或40μm预分离滤膜
实验方法
1、用5只小鼠的淋巴结或2只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞。
2、细胞在10mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。
3、细胞悬液在4℃，200g离心10min。弃上清后将沉淀按每108个细胞0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每108个细胞加入0.1ml适当的磁珠后在4℃孵育15min。
4、在孵育的时间里，打开AUTOMACS系统电源。按产品说明书中操作规程运行清洁程序。
5、细胞悬液在4℃，200g离心10min。弃上清，在沉淀中加入足量的MACS缓冲液使细胞浓度达到108个细胞/ml，充分混悬。将细胞通过30μm尼龙网或40μm预分离滤膜。用0.1～0.4mlMACS缓冲液冲洗滤网。
6、细胞放到AUTOMACS的上样通道。选择possel程序，这样标记的细胞将从阳性通道洗脱。
7、细胞悬液在4℃，200g离心10min。弃上清后将沉淀用2～5ml RPMI-10*培养基混悬。计数。
附录：
RPMI*培养基：
RPMI1640培养基含有:
2%、5%、10%、15%或20%FBS,56℃热灭活1h
2μmmol/L L-谷氨酰胺
50μmol/ml 2-ME
100U/ml 青霉素
100μg/ml 硫酸链霉素
RPMI-10*培养基：
配制RPMI*培养基加入:
10%（V/V）FBS
1mmol/L 丙酮酸钠
50μg/ml庆大霉素
10mmol/L HEPES
4℃可保存2周
过滤除菌
HBSS洗涤缓冲液：
HBSS，含有：
5%（V/V）FBS
20mmol/L HEPES，pH7.0
100U/ml 青霉素
100μg/ml 链霉素
4℃可保存1个月
MACS缓冲液：
PBS，pH7.2
0.5%（m/V）BSA
2mmol/L EDTA
过滤除菌
用于自动MACS系统，室温储存1个月
用于LS或LD柱时，脱气，4℃保存