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大兔原代晶状体上皮细胞培养
PriCells - 正常大兔原代晶状体上皮细胞培养
一、实验试剂
1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、检测试剂：抗兔Vimentin抗体，荧光标记二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）
二、实验器械
1、培养皿
2、培养瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科镊
5、200μl微量移液器及200μl的吸头
6、玻璃滴管
三、实验流程
取材
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清除巩膜外肌肉及结缔组织
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将眼球浸入含1×P/S 1 × PBS （pH 7.4 ）浸泡5min
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再用1 × PBS （pH 7.4 ）冲洗3遍
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在超净台中环形剪除角膜，放射状剪开并撕除虹膜
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用眼科镊尽量靠近赤道部撕下晶体前囊膜
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将前囊膜剪成1mm×1mm大小的碎片
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用吸头吸取组织块接种于培养瓶中，每小块间距0.5cm左右。
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翻转培养瓶，瓶底朝上，加入2ml培养基
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培养瓶倒置在培养箱中，干贴壁2-4h
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培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养，48h后换液
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观察到细胞爬出后，将组织块去除
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继续放置于37℃，5% CO2培养箱中。
四、实验操作
1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：首先在无菌条件下清除巩膜外肌肉及结缔组织后将眼球浸入含1×P/S PBS浸泡5min。
3、材料预处理：用1 × PBS （pH 7.4 ）冲洗3遍，在超净台中环形剪除角膜放射状剪开并撕除虹膜，充分暴露晶状体赤道部，用眼科镊尽量靠近赤道部撕下晶体前囊膜，将前囊膜剪成1mm×1mm大小的碎片。
4、组织贴块：取200μl的吸头一只，在酒精灯上用火焰烧弯。用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20－25块左右，每小块间距0.5cm左右。
5、贴壁处理：组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倒置在培养箱中，干贴壁2-4h。
6、培养：干贴壁完成后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养；48h后换液，更换2-3ml即可。
7、组织块去除：贴块贴壁培养4-7d后，在镜下观察可见大量细胞爬出，用吸管将组织块吹下、去除，继续放置于37℃，5% CO2培养箱中。
五、细胞鉴定
1、显微鉴定：相差显微镜下，可见细胞呈体积较细小呈类圆形透明状。细胞具备良好的透光性，传代后一经贴壁就铺呈多种形态生长。
2、免疫组织化学鉴定 ：利用Vimentin免疫荧光染色检测
3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×104个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。
4、细胞固定：用1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤细胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空气中自然干燥。
5、特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min。
6、洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
7、标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。
洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
8、封片：封片剂封片。
9、镜检：荧光显微镜下观察。
六、注意事项
1、材料预处理时要注意小心，不要破坏晶状体结构，要注意晶状体前后，确保撕取的是前囊膜。
2、将组织块贴于培养瓶中后，对于培养瓶的移动，翻转，加液等动作一定要轻柔，以免使组织块浮起。
3、去除组织块的时机要选择好，去除过早，细胞数量太少，会使细胞生长速度变慢，去除时间太晚，会使部分区域细胞生长过密，导致细胞老化，影响细胞状态。
4、严格控制上皮细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。
5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中，可以酌情考虑是否包被。
6、传代培养细胞接种量为5×104个（25 cm2培养瓶），细胞倍增时间为48小时。细胞传代培养最佳为3-5代，5代后晶体上皮细胞明显成纤维细胞化，呈梭形或条状，细胞大小不等，细胞相互分离形成拉网现象，传代消化时间会有所延长。
七、PriCells细胞图片
