DH10Bac 大腸桿菌克隆感受態(tài)細胞
產(chǎn)品信息：
組成 BC112-01
DH10Bac Competent cells 20×100μl
pUC19（0.1ng/μl） 5μl
儲存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融。
產(chǎn)品介紹：
大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞，適用于昆蟲桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)中同源重組的菌株，用于產(chǎn)生重組
Bacmid。是經(jīng)特殊工藝制備，使用pUC19質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率可達107 cfu/μg，-70℃保存幾個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)
生改變。
基因型：
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsLnupG
/pMON14272/pMON7124
產(chǎn)品特點：
DH10Bac 細胞包含親本 Bacmid bMON14272 和輔助質(zhì)粒 pMON7124 親本 Bacmid 包含一個 mini-F 復(fù)制子、
抗性基因、att Tn7 位點和 lac Zα-互補因子。輔助質(zhì)粒包含 tns ABCD 區(qū)域，該區(qū)域提供了 mini-Tn7
從供體質(zhì)粒插入親本 Bacmid 靶位點所需要的轉(zhuǎn)座蛋白。供體如 pFastBac 系列質(zhì)粒（pFastBac1，pFastBacDual
等）含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重組臂，Tn7R 和 Tn7L 之間包含抗性基因、昆蟲病毒多角體基因啟動子、
多克隆位點和 SV40 病毒的 PolyA 加尾信號。當含有靶基因 pFastBac 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 DH10Bac 細胞后，發(fā)
生重組后就可產(chǎn)生重組 Bacmid，提取純化重組 Bacmid 轉(zhuǎn)染昆蟲細胞 Sf9 或 Sf21 就可以包裝產(chǎn)生昆蟲病毒。
此外，DH10Bac細胞中的The φ80dlacZΔM15基因的產(chǎn)物可以實現(xiàn)β-半乳糖苷酶的α-互補現(xiàn)象，用于重組Bacmid
的藍白斑篩選。
操作步驟（以下操作均按無菌條件的標準進行）：
提示
?
感受態(tài)細胞應(yīng)保存在-70℃，不可多次凍融和放置時間過長，以避免降低感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率。
?
制備含下面抗生素的 LB 固體平板：
50μg/ml kanamycin、7μg/ml gentamicin、10μg/ml tetracycline、100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG。
1. 取感受態(tài)細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨毎麘乙悍盅b到無菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴
中。（一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的建議用量為 50-100μl，可以根據(jù)實際情況分裝使用。應(yīng)注意所用 DNA
體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一。)以下實驗以 100μl 感受態(tài)細胞為例。
2. 向感受態(tài)細胞懸液中加入 1-10ng 重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，在冰浴中靜置 30 分鐘。
3. 將離心管置于 42℃水浴中放置 90 秒，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻 2 分鐘，該過程不要搖
動離心管。
4. 向每個離心管中加入 900μl 無菌的 SOC（不含抗生素），混勻后置于 37℃ ,200rpm，搖床振蕩培養(yǎng) 4
小時。
5. 用 SOC 培養(yǎng)基進行 10 倍梯度稀釋，如分成 3 個稀釋梯度 10-1，10-2，10-3。
6. 取 100ul 的各個梯度的培養(yǎng)物用于涂布。等平板中的液體吸收后，倒置平板，37℃培養(yǎng) 24-48 小時。
7. 保留剩余的菌液于 4℃冰箱中，視平板上菌落生長情況決定去留。
相關(guān)試劑及培養(yǎng)基的制備方法：
1. LB 液體培養(yǎng)基：稱取 10g Tryptone，5g Yeast Extract 和 10g NaCl 置于 1L 燒杯中。加入約 800ml 的
去離子水，溶解后用 2mol/L 的 NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 值至 7.0。加去離子水定容至 1L。分裝
后，121℃高壓滅菌 20 分鐘。
2. SOB和SOC 培養(yǎng)基：稱取 20g Tryptone，5g Yeast Extract，0.5g NaCl 置于 1L 燒杯中加入約 800ml 的去
離子水，溶解后再補加 10ml 250mM KCl 溶液，滴加 5M NaOH（約 0.2ml）調(diào) pH 至 7.0。加入
去離子水將培養(yǎng)基定容至 1L。121℃滅菌 20 分鐘。使用時加入5ml 滅菌的 2M MgCl2溶液（此種培養(yǎng)
基稱為 SOB）。再補加經(jīng) 0.22μm 過濾除菌的 1M 葡萄糖溶液2ml（此種培養(yǎng)基為 SOC）。
3. 轉(zhuǎn)化復(fù)蘇細菌用的液體 LB 培養(yǎng)基或 SOC 培養(yǎng)基：可以一次高壓 50ml 液體培養(yǎng)基，無菌狀態(tài)按 1ml
每管分裝于高壓滅菌的 1.5ml 離心管中，裝于自封袋中，凍存于-20℃中，每次用一支?？梢詷O大地避
免培養(yǎng)基污染和減少勞動量。
4. LB 固體選擇培養(yǎng)基：100ml LB 液體培養(yǎng)基中加入 1.5g 瓊脂粉，搖勻后，121℃高壓滅菌 20 分鐘。
冷卻至 50℃左右時加入相應(yīng)濃度的抗生素（如 AMP 濃度通常為100μg/ml），混勻后倒在細菌用的無菌
培養(yǎng)皿中，等瓊脂凝固后即可使用。
5. IPTG：稱量 1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于 40ml 滅菌水，濃度為200mmol/L。用無菌0.22μm
過濾膜過濾除菌。小份分裝后，-20℃保存。
6. X-gal：用 DMF（二甲基甲酰胺）配制成 20mg/ml，小份分裝（1ml/份）后，-20℃避光保存。


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