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淋巴成纖維細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。
4、細胞計數(shù)與活力評估：在進行細胞傳代、復(fù)蘇或凍存前，進行細胞計數(shù)與活力評估是至關(guān)重要的步驟。①取少量細胞懸液，與等體積的0.4%臺盼藍溶液混合，靜置2-3分鐘。②使用血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計數(shù)活細胞（未被臺盼藍染色的細胞）與死細胞（被臺盼藍染成藍色的細胞）。③計算細胞總數(shù)及活力百分比（活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%）。確保細胞活力高于90%方可用于后續(xù)實驗，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

5、培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化：淋巴成纖維細胞的培養(yǎng)還需注意培養(yǎng)環(huán)境的細節(jié)優(yōu)化。①維持培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度恒定在37℃，濕度飽和，并通入5% CO?以保持適宜的pH值。②定期更換培養(yǎng)基，一般為每2-3天一次，以去除代謝產(chǎn)物，補充營養(yǎng)物質(zhì)。③使用經(jīng)過滅菌處理的器材和試劑，減少污染風(fēng)險。通過這些措施，可以進一步提升細胞的生長狀態(tài)，促進實驗的順利進行。