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細(xì)胞生長曲線的測定背景與原理:
生長曲線是測定細(xì)胞生長數(shù)的常用方法,也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo),是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后,經(jīng)過短暫的懸浮后貼壁, 隨后渡過長短不同的潛伏期,即進(jìn)入快速生長的指數(shù)生*。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后,停止生長,進(jìn)入平臺期,然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個過程中細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化,需連續(xù)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通常計(jì)數(shù)6天。為準(zhǔn)確起見,一般每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個平行重復(fù)。
材料、試劑與儀器
1、實(shí)驗(yàn)材料:
Hela細(xì)胞系。
2、實(shí)驗(yàn)試劑:
DMEM培養(yǎng)基(青霉素,鏈霉素 , 10%血清, 0.25%胰蛋白酶溶液，臺酚藍(lán)染液。
3、實(shí)驗(yàn)儀器:
超凈工作臺, co2培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,微量移液器,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,培養(yǎng)瓶,離心管，移液管,廢液缸,蓋玻片，24孔板。
方法與步驟
1、取生長良好的細(xì)胞,用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按5x104/mL作傳代培養(yǎng)接種于24孔板中,共接種21孔細(xì)胞。1 m/孔。余下三孔可設(shè)傳代培養(yǎng)的對照。
2、24h后每天記錄細(xì)胞數(shù)目,每次取3孔細(xì)胞,分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)7d。細(xì)胞用胰酶消化后加入一定量的培養(yǎng)基混勻制成細(xì)胞懸液。取少量懸液與臺酚藍(lán)1:1混臺。取一干凈的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,蓋上蓋片,從蓋片兩邊滴入細(xì)胞懸液使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片之間。注意滴液勿有氣泡,也不能太多，否則會使蓋片浮起而使細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)。
3、低倍鏡下觀察,活細(xì)胞不著色,臺盼藍(lán)著色的細(xì)胞呈深藍(lán)色,是不健康或已死亡的細(xì)胞,不能計(jì)數(shù)。
找出計(jì)數(shù)板上的方格,計(jì)算四角大格內(nèi)總細(xì)胞數(shù),大格線者只計(jì)左側(cè)和上方,不計(jì)右側(cè)和下方細(xì)胞懸液中細(xì)胞

密度計(jì)算公式為:細(xì)胞數(shù)mL= (四角大格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/4) x104x2
4、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果,以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)mL)為縱坐標(biāo),以時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。