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脈動真空滅菌器的工作原理基于微生物在受到熱力作用時，其蛋白質分子的運動加速，互相撞擊，導致連接肽鏈的付鍵斷裂，促使其分子由有規律的緊密結構變為無秩序的散漫結構，造成大量的疏水基暴露于分子表面并互相結合成為較大的聚合體而凝固沉淀。這個過程通過不可逆地破壞酶和結構蛋白，繼而達到殺滅微生物的目的。具體來說，脈動真空滅菌器在開始滅菌過程時，首先通過真空泵將滅菌器內部的空氣和蒸汽抽出，形成一定程度的真空，然后通過蒸汽發生器注入一定量的蒸汽，從而使滅菌器內部形成高溫高濕的環境，從而對滅菌物品進行滅菌。這個過程包括預真空和脈動真空兩個階段，預真空是在高壓蒸汽滅菌在對滅菌室進蒸汽前，進行一次抽真空，盡量排除滅菌室內的空氣后再進入蒸汽進行滅菌的方法；脈動真空則是反復多次地對滅菌室進行抽真空，即抽完一次真空，再向滅菌室進入一定量的蒸汽，讓剩余空氣和蒸汽進行混合并達到一定的正壓再進行抽真空，經過反復多次的抽真空最后進入蒸汽滅菌的方法。
脈動真空滅菌器的應用范圍廣泛，包括醫療器具、手術器械濕熱滅菌和滅菌后的干燥處理，以及在制藥行業中對瓶塞、操作工具、大量的工作服等不需降溫防爆的布類物品或藥品進行滅菌。此外，它還可用于食品滅菌和藥材的滅菌、熏蒸和烘干。
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