- 概要
呕吐毒素也称为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），是由串珠镰刀菌、轮状镰刀菌以及多育镰刀菌等产生的真菌毒素，大多存在于粮谷、饲料及其制品中。中毒后影响消化系统和神经系统，主要表现为恶心、呕吐、头痛、头晕、腹痛、腹泻等症状。我国标准规定：玉米、大麦、小麦及其制品中呕吐毒素不得超过1mg/kg，猪、犊牛、泌乳期动物配合饲料中呕吐毒素不得超过1mg/kg，牛、家禽配合饲料中呕吐毒素不得超过5mg/kg。
- 原理
测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有抗抗体。加入呕吐毒素（DON）标准品或样品、酶标抗原和抗体后，游离的呕吐毒素与酶标抗原竞争结合抗体，抗体或抗体结合物与固定在微孔板上的抗抗体再结合，没有结合的标准品、酶标抗原及抗体被洗去，加入TMB底物显蓝色，加入终止液后颜色由蓝变黄，用酶标仪在450nm处检测，吸光值与样品中呕吐毒素含量成负相关，与标准曲线比较即可得出呕吐毒素的含量。
- 试剂盒的组成
- 包被有抗抗体的96微孔板：1块（96 孔，12 条×8 孔）
- DON标准品：0ng/mL 、10ng/mL、
40ng/mL、100ng/mL、250ng/mL 1 瓶 × 1.0mL
- DON抗体： 1 瓶 × 10mL
- DON酶标抗原： 1 瓶 × 10mL
- 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50mL
- DON稀释缓冲液A： 1 瓶 × 50mL
- DON稀释缓冲液B： 1 瓶 × 50mL
- 显色底物TMB： 1 瓶 × 17mL
- 终止液： 1 瓶 × 7mL
- 试剂盒说明书： 1份
- 质检报告： 1份
- 需要的仪器、试剂
- 仪器
- 酶标仪 450nm（iELisa全自动酶标仪或相当者）
- 微量移液器：20μL-200μL单道，100μL-1000μL单道, 50μL-300μL八道
- 多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器）
- 酶标板振荡器
- 涡旋混合器
- 离心机
- 50mL离心管
- 1.5mL离心管
- 定性滤纸
- 过滤漏斗
- 天平：感量0.01g
- 试剂
- 纯水（蒸馏水、去离子水）
- 样品处理
5.1谷物（玉米、小麦、大麦、大米、大豆）：
- 称取5.0g粉碎样品于50mL离心管中，加入25.0mL样品提取液纯水,置于多功能旋转混合器上振荡10分钟（或使用高速均质器均质3分钟，或摇床上振荡40分钟），3000转/分离心5分钟。
- 将上层提取液用普通滤纸过滤，吸取100μL滤液置于1.5mL离心管中，加入400μL DON稀释缓冲液A，用涡旋混合器混匀。
稀释倍数：25
5.2饲料（高灵敏度）：
- 称取5.0g粉碎样品于50mL离心管中，加入25.0mL样品提取液纯水,置于多功能旋转混合器上振荡10分钟（或使用高速均质器均质3分钟，或摇床上振荡40分钟），3000转/分离心5分钟。
- 将上层提取液用普通滤纸过滤，测pH值，如果不在pH6-8范围内，请用酸或碱，进行调整。
- 吸取100μL滤液置于1.5mL离心管中，加入400uL DON稀释缓冲液B，用涡旋混合器混匀。
稀释倍数：25
5.3饲料：
- 称取5.0g粉碎样品于50mL离心管中，加入25.0mL样品提取液纯水,置于多功能旋转混合器上振荡10分钟（或使用高速均质器均质3分钟，或摇床上振荡40分钟），3000转/分离心5分钟。
- 将上层提取液用普通滤纸过滤，测pH值，如果不在pH6-8范围内，请用酸或碱，进行调整。
- 吸取50μL滤液置于1.5mL离心管中，加入450uL DON稀释缓冲液B，用涡旋混合器混匀。
稀释倍数：50
5.4发酵液：
- 吸取40μL液体样品置于1.5mL离心管中
- 加入960μL DON稀释缓冲液B，用涡旋混合器混匀。
稀释倍数：25
5.5尿液样品：
- 取5mL待检样品于15mL离心管中，3000r/min，离心10分钟
- 吸取100μL离心后澄清样品置于1.5mL离心管中
- 加入400μL DON稀释缓冲液A，用涡旋混合器混匀。
稀释倍数：5
6． 酶联免疫分析程序
6.1测定之前注意事项
- 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。
- 使用后迅速将试剂放入2-8℃冷藏。
- 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
- 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖板覆盖住酶标板。
6.2溶液的配制
- 提取液的配制:纯水（或蒸馏水、去离子水）。
- 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释10倍后使用。（例如：取10 mL 浓缩液+90 mL纯水, 可以用于32孔的检测）。
6.3测定程序
- 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
- 吸取50μL 标准品或样品分别加至相应的微孔（双孔）中，然后各加入50μL的DON酶标抗原、50μL的DON抗体，加盖，在室温温育30分钟（每个标准品和样品必须使用新的吸头）。
- 倒出孔中的液体，每孔加入250μL 稀释好的洗涤液，置于酶标板振荡器上振荡30秒（或者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在吸水纸上拍干。
- 每孔加入150μL底物，室温避光温育10分钟。
- 每孔加入50μL 终止液。
- 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸光度值（OD值），参比波长630nm。（iELisa全自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。
7. 结果判定
- 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以DI一个标准（0标准）的吸光度值（B<苏b>0）再乘以*，即百分吸光度值。
以呕吐毒素标准品浓度值（ppb）为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。
- 样品的实际浓度为读数结果乘以相应的稀释倍数。
- 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一定的比例用纯水进行稀释。
8. 注意事项
- 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。
- 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。
- 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在光线下。
- 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。
- 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。
- 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不准确。
- 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。
9. 试剂盒的性能指标
- 检测限LOD: 谷物0.15ppm（mg/kg），饲料0.25ppm（mg/kg），发酵液0.15ppm（mg/kg）,尿液0.05ppm（mg/kg）。（LOD：空白样品测定值+2倍标准偏差SD）
- 定量限LOQ: 谷物0.25ppm（mg/kg），饲料0.5ppm（mg/kg），发酵液0.25ppm（mg/kg）,尿液0.1ppm（mg/kg）。
- 定量检测范围：谷物0.25-6.0ppm，饲料0.5-12.0ppm，发酵液0.25-6.0ppm,尿液0.1-1.0ppm。
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