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透射電鏡樣本準(zhǔn)備方法及要求

 

以下所有樣本必須新鮮，固定液或懸浮液都不得冷凍結(jié)冰！

 

1、 動(dòng)物組織樣本

① 1-3min內(nèi)取樣，取材前可提前準(zhǔn)備裝有電鏡固定液的培養(yǎng)皿，將小組織塊離體取下后立即投入培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)刀在培養(yǎng)皿的固定液中進(jìn)行切割成小塊，取樣組織體積控制在以下尺寸(1mmX1mm×1mm正方體、1mm×1mm×3mm長方體狀、1mm×2mm×3mm薄片狀)。固定液滲透能力有限，超出此范圍后組織會(huì)無法固定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法完成，務(wù)必請(qǐng)重視此過程

 

 

 

 

 

 

 

② 取材時(shí)盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì)；觀察胰島取胰島豐富的胰尾；皮膚，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進(jìn)行固定）。

③ 取材時(shí)一定注意避免鑷子擠壓等機(jī)械損傷，刀片要鋒利避免挫傷組織。

④ 組織取下后立即投入電鏡固定液內(nèi)4度避光固定24h，再轉(zhuǎn)移至4°保存，4°冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中樣本和冰袋需間隔，固定液切勿冷凍結(jié)冰。4°時(shí)樣本可保存1個(gè)月左右

2、 植物組織樣本

① 取材要求同動(dòng)物組織樣本。

② 組織投入固定液后需要進(jìn)行真空抽氣讓組織沉底，如無條件抽氣可用濾紙將組織塞進(jìn)固定液內(nèi)，組織不能漂浮在固定液表面。（抽氣做出來的效果會(huì)好一些）

3、 細(xì)胞樣本

貼壁細(xì)胞：

（看細(xì)胞凋亡的，需要把培養(yǎng)液中的細(xì)胞也離心收集后固定）

方法一：消化法（實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟簧婕坝^察細(xì)胞膜相關(guān)的內(nèi)容  如：觀察緊密連接）

①培養(yǎng)好的細(xì)胞（細(xì)胞密度不超過70%）棄培養(yǎng)基，加入胰酶消化。

②胰酶消化好后（時(shí)間不宜過長），加培養(yǎng)基終止消化，吸管輕輕吹打至細(xì)胞起浮。吸入離心管，低速離心（不超過3000轉(zhuǎn)），3-5min左右，離心后管底要有肉眼可見的細(xì)胞沉淀，厚度不要超過2毫米。

③棄上清，緩慢加入電鏡固定液（固定液需提前恢復(fù)至室溫）。加固定液過程中不要吹散細(xì)胞，如果吹散了需再次低速離心。

④4度避光固定24h，再轉(zhuǎn)移至4°保存，4°冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中樣本和冰袋需間隔，固定液切勿冷凍結(jié)冰。

方法二：刮取法

①培養(yǎng)好的細(xì)胞（細(xì)胞密度不超過70%）棄培養(yǎng)基，加入電鏡固定液（固定液需提前恢復(fù)至室溫）。

②常溫避光固定5min左右，用細(xì)胞刮（或軟橡膠蓋切得平整小方塊）沿一個(gè)方向輕輕刮下細(xì)胞，切記不要反復(fù)刮，避免細(xì)胞刮破。

③用巴氏吸管把細(xì)胞液吸入離心管內(nèi)，放入離心機(jī)（不超過3000轉(zhuǎn)），低速離心3-5min左右，離心后管底要有肉眼可見的細(xì)胞沉淀，厚度不要超過2毫米。

④棄上清，緩慢加入電鏡固定液（固定液需提前恢復(fù)至室溫）。緩慢加入固定液過程中不要吹散細(xì)胞，如果吹散了需再次低速離心。

 

⑤4度避光固定24h，再轉(zhuǎn)移至4°保存，4°冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中樣本和冰袋需間隔，固定液切勿冷凍結(jié)冰。

懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀有綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液4度避光固定24h，再轉(zhuǎn)移至4°保存，4°冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中樣本和冰袋需間隔，固定液切勿冷凍結(jié)冰。

 

4、 細(xì)菌樣本

長于固體培養(yǎng)基的細(xì)菌：連帶著培養(yǎng)基一起挑下細(xì)菌放于電鏡固定液內(nèi)4度避光固定24h，再轉(zhuǎn)移至4°保存， 4°冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中樣本和冰袋需間隔，固定液切勿冷凍結(jié)冰。

 

懸浮細(xì)菌孢子等：離心收集細(xì)菌要肉眼可見細(xì)菌沉淀綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液4度避光固定24h，再轉(zhuǎn)移至4°保存，4°冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中樣本和冰袋需間隔，固定液切勿冷凍結(jié)冰。

5、 病毒

破碎組織細(xì)胞，粗離心去除細(xì)胞碎片取上清，超速離心分離出病毒（病毒提取的過程需要客戶自己完成）。用緩沖液（如PBS）懸浮病毒，體積至少50ul，遠(yuǎn)距離干冰凍存運(yùn)輸，近距離4°保存運(yùn)輸，盡快滴片做負(fù)染后及時(shí)電鏡觀察拍照。（噬菌體 4度運(yùn)輸）

6、 外泌體囊泡等

客戶自己完成外泌體囊泡等的提取收集，用緩沖液（如PBS）或者試劑盒中的保存液懸浮，，體積至少50ul，遠(yuǎn)距離干冰凍存運(yùn)輸，近距離4°保存運(yùn)輸，盡快制片做負(fù)染后及時(shí)電鏡觀察拍照。（因此類樣品極易降解，樣品越新鮮越好，最好數(shù)小時(shí)內(nèi)完成滴片負(fù)染，否則做出的效果很不理想甚至觀察不到）

7、 納米材料等無機(jī)材料

直接準(zhǔn)備粉劑，或用純水或無水乙醇懸浮，常溫保存運(yùn)輸即可（需要超聲的備注）。做負(fù)染后電鏡觀察拍照。