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Seahorse XF 細胞線粒體壓力測試實驗
閱讀：4338 發(fā)布時間：2020-11-13全面了解線粒體功能
1、實驗背景
安捷倫 SeahorseXF 細胞線粒體壓力測試通過在 Seahorse XFe 和 XF 細胞外流量分析儀上直接測量細胞的氧消耗速率（OCR）來表征線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)。它是基于培養(yǎng)板的活細胞實驗，能夠?qū)崟r監(jiān)測 OCR。
實驗使用 XF 傳感器探針板內(nèi)置的加藥孔在實驗過中將呼吸作用的調(diào)節(jié)劑加入細胞孔中，從而得到反映線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)。實驗試劑盒里的調(diào)節(jié)劑為寡霉素（Oligomycin），羰基氰-4（三氟甲氧基）苯腙（Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy)Phenylhydrazone，F(xiàn)CCP），魚藤酮（Rotenone）和kang霉素 A（Antimycin A）。
圖1 安捷倫SeahorseXF細胞線粒體壓力測試曲線，展示線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)
圖 2 安捷倫 SeahorseXF 細胞線粒體壓力測試 ETC 的調(diào)節(jié)劑，闡述電子傳遞鏈（ETC）復(fù)合物，并顯示 Seahorse XF細胞線粒體壓力測試試劑盒包含的所有調(diào)節(jié)劑的作用靶點。
寡霉素抑制 ATP 合酶（復(fù)合物 V），是實驗中在基礎(chǔ)測量之后一次注射的化合物。它影響或減少通過 ETC 的電子流，導(dǎo)致線粒體呼吸或 OCR 減少。減少的 OCR 與細胞 ATP 的產(chǎn)生相關(guān)。
羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）是一個解偶聯(lián)劑，它破壞質(zhì)子梯度和線粒體膜電位。它是寡霉素后第二次注射的化合物。加入的結(jié)果是，通過ETC的電子流不受限制，復(fù)合物IV耗氧量達到大。FCCP激發(fā)的OCR可用來計算備用呼吸能力，它的定義是大呼吸和基礎(chǔ)呼吸的差值。備用呼吸能力衡量細胞對增加的能量需求或壓力的反應(yīng)能力。
第三次注射的是復(fù)合物I的抑制劑魚藤酮和復(fù)合物III的抑制劑kang霉素A的混合物。它們聯(lián)合關(guān)閉了線粒體呼吸，從而能夠計算由線粒體外的過程驅(qū)動的非線粒體呼吸。
表1總結(jié)了這些化合物的作用效果。
表1線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑作用靶點和效果總結(jié)
化合物 | ETC靶點 | 對OCR的影響 |
寡霉素 | ATP合酶（復(fù)合物V） | 減少 |
FCCP | 線粒體內(nèi)膜 | 增加 |
魚藤酮/kang霉素A | 分別為復(fù)合物I和III | 減少 |
對線粒體功能進行評估使研究人員能夠進一步了解代謝在細胞生理學(xué)，疾病病理學(xué)和病因?qū)W中的關(guān)鍵作用。
SeahorseXF細胞線粒體壓力測試是測量細胞線粒體功能的金標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛應(yīng)用。本實驗為了解線粒體功能障礙的原因和深入理解代謝途徑，信號和表型提供了視角。
詞匯表：
· 基礎(chǔ)呼吸（Basal respiration）：用來滿足細胞ATP需求和線粒體質(zhì)子滲漏的氧消耗。表示細胞在基礎(chǔ)條件下的能量需求。
· ATP產(chǎn)生（ATP Production）：加入ATP合酶抑制劑寡霉素后減少的氧氣消耗速率，代表基礎(chǔ)呼吸中被用來驅(qū)動ATP產(chǎn)生的部分。表示用來滿足細胞能量需求的線粒體ATP產(chǎn)生。
· H+（質(zhì)子）滲漏（H+ (Proton) leak）：與 ATP產(chǎn)生不偶聯(lián)的基礎(chǔ)呼吸的剩余部分。質(zhì)子滲漏可以被看作是線粒體損傷的標(biāo)志，也可被看作是一種調(diào)節(jié)線粒體ATP產(chǎn)生的機制。
· 大呼吸（Maximal respiration）：加入解偶聯(lián)劑FCCP之后獲得的大氧氣消耗速率。FCCP通過刺激呼吸鏈以大能力運轉(zhuǎn)模擬生理的“能量需求”，導(dǎo)致底物（糖，脂肪和氨基酸）的快速氧化以應(yīng)對這一代謝挑戰(zhàn)。顯示細胞能夠達到的大呼吸速率。
· 備用呼吸能力（Spare respiratory capacity）：這個測量指標(biāo)表示細胞應(yīng)對能量需求的能力以及細胞呼吸與其理論大值的差距。細胞應(yīng)對能量需求的能力可作為細胞適應(yīng)性或靈活性的一個指標(biāo)。
· 非線粒體呼吸（Nonmitochondrial respiration）：加入魚藤酮和kang霉素A后，由于一部分細胞中的酶繼續(xù)消耗氧而存留的氧消耗。這對于線粒體呼吸的準(zhǔn)確測量很重要。
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