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DNA甲基化檢測科研實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)介紹

時間:2024/9/26閱讀:115
DNA甲基化檢測


應(yīng)用簡介
       DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制,DNA甲基化檢測是指利用各種方法對腫瘤細(xì)胞DNA甲基化程度進(jìn)行測定。在惡性腫瘤的發(fā)展中,甲基化的狀態(tài)并不是一成不變,腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進(jìn)展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系,DNA甲基化檢測對腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
技術(shù)原理
       DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制,DNA甲基化檢測是指利用各種方法對腫瘤細(xì)胞DNA甲基化程度進(jìn)行測定。在惡性腫瘤的發(fā)展中,甲基化的狀態(tài)并不是一成不變,腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進(jìn)展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系,DNA甲基化檢測對腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
       甲基化特異性的PCR(Methylation-specificPCR,MSP)
       Herman等(1996)在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏感性高,主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物,如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段,則說明該位點(diǎn)存在甲基化;反之,說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化。 
       特點(diǎn):適用范圍廣,能夠檢測特異位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。
       亞硫酸氫鹽測序法(BisulfitesequencingPCR,BSP)
       亞硫酸氫鹽修飾后測序法(BSP)Frommer等(1992)提出的研究DNA甲基化方法,此方法可靠性及精確度高,能明確目的片段中每一個CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計BSP引物進(jìn)行PCR,在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶,最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化,稱為BSP-直接測序法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測序,可以提高測序成功率,這種方法稱為BSP-克隆測序法。
       特點(diǎn):精確度高,能夠準(zhǔn)確檢測出甲基化的程度百分比。
實(shí)驗(yàn)方法

常見問題
       怎樣確定基因的目標(biāo)區(qū)域來進(jìn)行甲基化分析呢?
       轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的CpG島進(jìn)行DNA甲基化分析的shou選區(qū)域,一般位于啟動子或者5‘UTR區(qū)。
       為什么文獻(xiàn)報導(dǎo)的甲基化序列不在CpG島中?
       沒有明顯的CpG島不代表就沒有甲基化,甲基化也可能發(fā)生在并不密集的CG區(qū)域。
       BSP甲基化擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物可否直接測序,為什么需要構(gòu)建TA克隆后測序?
       如果進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序就有可能在原有的C位點(diǎn)得到雙峰圖,無法確定甲基化的程度。
 


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