應(yīng)用簡介
DNA甲基化是基因表達調(diào)控的一種重要機制，DNA甲基化檢測是指利用各種方法對腫瘤細胞DNA甲基化程度進行測定。在惡性腫瘤的發(fā)展中，甲基化的狀態(tài)并不是一成不變，腫瘤細胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系，DNA甲基化檢測對腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
技術(shù)原理
DNA甲基化是基因表達調(diào)控的一種重要機制，DNA甲基化檢測是指利用各種方法對腫瘤細胞DNA甲基化程度進行測定。在惡性腫瘤的發(fā)展中，甲基化的狀態(tài)并不是一成不變，腫瘤細胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系，DNA甲基化檢測對腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
甲基化特異性的PCR（Methylation-specificPCR，MSP）
Herman等（1996）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。
特點：適用范圍廣，能夠檢測特異位點是否發(fā)生甲基化。
亞硫酸氫鹽測序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）
亞硫酸氫鹽修飾后測序法（BSP）Frommer等（1992）提出的研究DNA甲基化方法，此方法可靠性及精確度高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態(tài)。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對PCR產(chǎn)物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
特點：精確度高，能夠準確檢測出甲基化的程度百分比。
實驗方法

常見問題
怎樣確定基因的目標區(qū)域來進行甲基化分析呢？
轉(zhuǎn)錄起始位點附近的CpG島進行DNA甲基化分析的shou選區(qū)域，一般位于啟動子或者5‘UTR區(qū)。
為什么文獻報導(dǎo)的甲基化序列不在CpG島中？
沒有明顯的CpG島不代表就沒有甲基化，甲基化也可能發(fā)生在并不密集的CG區(qū)域。
BSP甲基化擴增得到的PCR產(chǎn)物可否直接測序，為什么需要構(gòu)建TA克隆后測序？
如果進行PCR產(chǎn)物測序就有可能在原有的C位點得到雙峰圖，無法確定甲基化的程度。

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