免疫印跡（Western blot）檢測科研實驗技術服務介紹

時間：2024/9/26閱讀：157

免疫印跡（Western blot）檢測

應用簡介
蛋白質免疫印跡法(WesternBlot)，簡稱WB，是指通過SDS-PAGE膠將不同分子量的蛋白質分離開，然后將目標蛋白轉移到載體(PVDF)膜上，利用抗原抗體的特異性結合，用特異性的一抗結合目標蛋白，用HRP標記的二抗結合一抗，再加以ECL發(fā)光液顯色，檢測組織或者細胞內某種或者某些特異性蛋白質的表達。蛋白質免疫印跡是做蛋白質分析的一種常規(guī)技術，常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析，還可以用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA相互作用后續(xù)分析。WB技術現已廣泛應用于蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個研究領域。
技術原理
通過SDS-PAGE凝膠將細胞或生物樣品內的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜或PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應（目前主要用HRP標記的第二抗體），經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分（目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應發(fā)出熒光，通過儀器或者膠片顯色）。該技術廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
實驗方法

常見問題
1、WB有什么優(yōu)點？
靈敏，可達ng級，用ECL顯色法可達pg級。靈敏，相對便宜且特異性高。
2、細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
有沉淀可能因為蛋白沒有變性晚全，可以適當提高SDS的濃度，同時將樣品煮沸時間延長，一般需96℃以上10-15min左右；也不排除抗原濃度過高，這時需再加入適量上樣緩沖液。
3、膠片背景很臟，有什么解決方法？
減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時間和溫度(盡量4℃過夜，此孵育條件比37℃1h要溫和很多)，并提高封閉液濃度。
4、目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？
一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP催化活力太強，同時顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現象"。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新進口的顯色底物。
5、電泳中常出現的一些現象：
①“︶"條帶呈笑臉狀
原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好；電泳系統(tǒng)溫度偏高，而且電場強度太大(電泳的電場大致呈現U形，所以因為趕時間而加大電壓可能會出現這個)。
②“︵"條帶呈皺眉狀
原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不晚全。
③條帶拖尾
原因：樣品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。
④紋理(縱向條紋)
原因：樣品中含有不溶性顆粒，可能抽提蛋白時出了問題。
⑤條帶偏斜
原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜，一定要子平面臺子上電泳，膠要做好。
⑥條帶兩邊擴散
原因：加樣量過多，彌散至孔周圍了，減少上樣量或者使用5X上樣緩沖液。

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