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應用簡介
蛋白質免疫印跡法(WesternBlot),簡稱WB,是指通過SDS-PAGE膠將不同分子量的蛋白質分離開,然后將目標蛋白轉移到載體(PVDF)膜上,利用抗原抗體的特異性結合,用特異性的一抗結合目標蛋白,用HRP標記的二抗結合一抗,再加以ECL發(fā)光液顯色,檢測組織或者細胞內某種或者某些特異性蛋白質的表達。蛋白質免疫印跡是做蛋白質分析的一種常規(guī)技術,常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進行定性和半定量分析,還可以用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA相互作用后續(xù)分析。WB技術現(xiàn)已廣泛應用于蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個研究領域。
技術原理
通過SDS-PAGE凝膠將細胞或生物樣品內的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜或PVDF膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(目前主要用HRP標記的第二抗體),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分(目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應發(fā)出熒光,通過儀器或者膠片顯色)。該技術廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
實驗方法
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