大鼠凋亡相关因子配体(FASL)ELISA试剂盒实验使用说明书

　　试剂盒简介

　　大鼠凋亡相关因子配体(FASL)ELISA试剂盒是一种用于体外定量检测大鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中FASL含量的实验工具。该试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)原理，具有高灵敏度、高特异性和良好的重复性?。

　　BS-3034大鼠凋亡相关因子配体(FASL)ELISA试剂盒

　　实验原理

　　本试剂盒基于双抗体夹心法ELISA技术。预先包被的大鼠FASL抗体会与样本中的FASL结合，再加入HRP标记的检测抗体形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤后加入TMB底物显色，颜色的深浅与样品中FASL浓度呈正相关。最后在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品浓度?。

　　试剂盒组成

　　主要组分

　　酶标包被板：预包被抗体的96孔或48孔微孔板(2-8℃保存)

　　标准品：通常为720pg/ml或40ng/ml浓度(2-8℃保存)

　　酶标试剂：HRP标记的检测抗体(2-8℃保存)

　　显色剂：TMB溶液(A液和B液分开保存，2-8℃避光)

　　终止液：2M硫酸溶液(2-8℃保存)

　　浓缩洗涤液：20倍或30倍浓缩(2-8℃保存)?

　　其他配件

　　封板膜：用于反应过程中封闭微孔板

　　密封袋：用于保存未使用的酶标板

　　说明书：详细操作指南?

　　样本处理要求

　　血清样本

　　室温血液自然凝固10-20分钟

　　2000-3000转/分离心20分钟

　　仔细收集上清，避免溶血

　　如出现沉淀，需再次离心

　　短期可2-8℃保存48小时，长期需-20℃或-80℃保存，避免反复冻融?

　　血浆样本

　　使用EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂

　　采集后30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟

　　收集上清，保存条件同血清?

　　组织匀浆

　　用预冷PBS(0.01M, pH7.4)冲洗组织，去除残留血液

　　按1:9重量体积比加入PBS(含蛋白酶抑制剂)

　　冰上充分研磨，可超声破碎或反复冻融辅助裂解

　　5000×g离心5-10分钟，取上清检测?

　　实验操作步骤

　　试剂准备

　　将所有试剂平衡至室温(约30分钟)

　　配制洗涤液：蒸馏水按1:20或1:25稀释浓缩洗涤液

　　标准品梯度稀释：按照说明书要求进行系列倍比稀释

　　酶标工作液配制：临用前按比例稀释?

　　加样与孵育

　　设置空白孔、标准品孔和样品孔

　　空白孔加样品稀释液，标准品孔加不同浓度标准品，样品孔加待测样本

　　每孔加样50-100μl，轻轻混匀

　　贴上封板膜，37℃孵育40-60分钟?

　　洗涤

　　弃去孔内液体，每孔加满洗涤液(300μl)

　　静置2分钟后弃去，在滤纸上拍干

　　重复洗涤4-5次?

　　加酶标抗体

　　每孔加入HRP标记的检测抗体工作液100μl

　　贴上封板膜，37℃孵育30分钟

　　重复洗涤步骤?

　　显色

　　每孔加入TMB显色液100μl(临用前A液1:1混合)

　　37℃避光显色10-20分钟(观察颜色变化)

　　每孔加入终止液50-100μl终止反应?

　　测定

　　终止反应后30分钟内完成测定

　　酶标仪450nm波长读取各孔OD值

　　以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线

　　根据样品OD值计算FASL浓度，乘以稀释倍数?

　　注意事项

　　实验前

　　不同批号试剂不可混用

　　试剂使用前应充分混匀，避免产生气泡

　　平衡至室温后方可使用

　　准备好所有所需器材，避免实验中断?

　　实验中

　　严格控制孵育时间和温度

　　加样准确，避免孔间交叉污染

　　洗涤津，防止非特异性结合

　　显色时间可根据颜色深浅适当调整?

　　实验后

　　未用完的酶标板条应立即放回密封袋保存

　　废液应按照实验室规定处理

　　数据及时记录和分析?

　　结果分析

　　标准曲线

　　以标准品浓度为横坐标(X轴)，对应OD值为纵坐标(Y轴)，绘制标准曲线。推荐使用四参数逻辑(4-PL)曲线拟合，R2值应≥0.99?。

　　计算

　　根据样品OD值，从标准曲线计算出相应浓度，再乘以稀释倍数即为实际浓度。若样品OD值超出标准曲线范围，应适当稀释后重新测定?。

　　保存条件

　　未开封试剂盒：-℃保存，有效期6个月

　　开封后试剂：按说明书要求保存，部分需周内用完4]

　　常见问题解决

　　高背景

　　检查洗涤是否充分

　　确认封闭步骤是否到位

　　. 避免酶标抗体浓度过高

　　缩短显色时间]

　　低信号

　　. 检查试剂是否失效

　　. 确认孵育时间和温度是否足够

　　. 样本中目标蛋白浓度可能过低，需浓缩样本]

　　标准曲线不佳

　　. 检查标准品稀释是否正确

　　2. 确认酶标仪功能正常

　　3. 避免显色过度或不足]

　　注：以上资料仅供参考，如需完整版产品信息请咨询品牌供应商或技术老师。

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