沙门氏菌SPP-spy荧光PCR核酸检测试剂盒?说明书

【产品名称】

通用名称：沙门氏菌SPP核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)  

Name  ：Salmonellaspp. Detection Kit (Real-Time PCRMethod)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

沙门氏菌(Salmonella spp.) 是肠杆菌科中一大类重要的致病菌，感染畜禽后可引起一系列的疾病，成为畜禽肉胴体、畜禽产品污染的重要来源，并可以通过各种途径传染给人，引起人的食源性疾病[1]。为有效地预防和控制疾病发生，建立快速、敏感而又特异的检测方法，PCR技术已成为检测食品、临床样品和环境样品中沙门氏菌的重要手段[2,3]。

本试剂盒适用于检测水样粪便，疑似污染的水、食物等样本中的沙门氏菌，用于沙门氏菌感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，设计一对沙门氏菌特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对沙门氏菌的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】

水样便取0.5~1mL；疑似污染的食物取1g

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

水样便13000rpm离心2min，去尽上清；疑似污染的食物用手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；疑似污染的水直接取100μL

1.2DNA提取

1)对上述处理好的标本加入50μL核酸提取液，100℃恒温处理10min，13,000 rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；

2)DNA的提取也可以采用上海烜雅生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光，选择None即可。

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道Ct值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤35.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线。

7.质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【参考文献】

[1] 曾晓芳. 畜产品中沙门氏菌污染的检测与控制[J]. 四川畜牧兽医, 2003, 30(4):28-29.

[2] Marijia T, Gorazd A, An improved 16S rRNA based PCR method for the specific detection of Salmonella enteria [J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 80: 67-75.

[3] Judy S W, Karen L J, Suresh D P, et al. Specific detection of Salmonella spp. By multiplex polymerase chain reaction [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(5): 1473-1479.

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