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簡述重組人EGF的制備方式

2024-8-26  閱讀(179)

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  重組人EGF的制備方式涉及基因工程、蛋白質(zhì)表達及純化技術(shù)。在現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域,重組人EGF的制備主要通過大腸桿菌等表達系統(tǒng)實現(xiàn)。這一過程包括基因合成、構(gòu)建表達載體、轉(zhuǎn)化宿主細胞、誘導(dǎo)表達以及蛋白純化等關(guān)鍵步驟。具體介紹如下:
  1.表達系統(tǒng)的選擇和基因合成:
  表達系統(tǒng)選擇:常用于生產(chǎn)重組人EGF的表達系統(tǒng)是大腸桿菌(Escherichia coli),這是因為其具有快速生長、操作簡單、成本低廉等特點。
  基因合成與克隆:人工合成人EGF基因或者從人類基因組中提取EGF基因,然后將其插入到合適的表達載體中,這些載體通常會引入特定的標簽序列(如His標簽),以便后續(xù)的純化工作。
  2.融合蛋白的表達及純化:
  融合蛋白表達:為了增強EGF的可溶性和簡化純化流程,通常會將EGF基因與某種融合標簽(如SUMO蛋白)結(jié)合表達為融合蛋白。這種融合蛋白可以提高目標蛋白的穩(wěn)定性并降低被宿主細胞內(nèi)蛋白酶降解的風(fēng)險。
  蛋白純化:利用融合標簽與金屬離子的親和性,通過親和層析方法(例如鎳柱親和層析)來純化融合蛋白。然后通過特定的蛋白酶識別位點將融合標簽與EGF切割分離,從而得到高純度的EGF蛋白。
  3.蛋白折疊和活性檢測:
  蛋白重新折疊:由于大腸桿菌表達系統(tǒng)缺乏真核生物的蛋白折疊機制,因此重組蛋白通常以包涵體形式存在。需要通過重新折疊的過程,使人EGF恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性。
  活性檢測:采用生物活性測定方法(例如,利用Balb/C 3T3小鼠胚胎成纖維細胞進行細胞增殖試驗)來驗證人EGF的生物活性,確保其具備正常的生物學(xué)功能。
  4.蛋白的保存和包裝:
  保存條件:純化后的重組人EGF一般保存于-20℃以下的環(huán)境中,以防止蛋白質(zhì)降解或失去活性。
  產(chǎn)品包裝:根據(jù)實際用途進行分裝,并確保全程無菌操作,以免污染。

重組人EGF

 

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