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化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的規(guī)范操作方法

2020-12-4  閱讀(1439)

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   化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞是常規(guī)克隆和亞克隆實(shí)驗(yàn)應(yīng)用較為合適的解決方案。經(jīng)氯化鈣處理,促進(jìn)質(zhì)粒DNA黏附于感受態(tài)細(xì)胞膜上。將感受態(tài)細(xì)胞通過水浴熱激,使細(xì)胞膜孔打開,從而質(zhì)粒可以進(jìn)入。
  操作方法:(以下操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行)
  1、取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中,如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無菌預(yù)冷的離心管中,置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100μl,可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。應(yīng)注意所用DNA體積不要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。
  以下實(shí)驗(yàn)以100μl感受態(tài)細(xì)胞為例。
  2、向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA(50μl的感受態(tài)細(xì)胞能夠被1ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和),輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物,在冰浴中靜置30分鐘。
  3、將離心管置于42℃水浴中放置90秒,然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻2-3分鐘,該過程不要搖動離心管。
  4、向每個(gè)離心管中加入500μl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基(不含抗生素),混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45分鐘(150轉(zhuǎn)/分鐘),目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá),使菌體復(fù)蘇。
  5、將離心管內(nèi)容物混勻,吸取100μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上,用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收,倒置平板,37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。
  注:涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多,可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板;反之,如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少,可取200-300μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計(jì)的克隆較少,可通過離心(4,000rpm,2分鐘)后吸除部分培養(yǎng)液,懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。(涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板)
  注意事項(xiàng):
  1.進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí),應(yīng)根據(jù)相應(yīng)溫度及無菌條件的要求進(jìn)行。
  2.感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃,不可多次凍融和放置時(shí)間過長,以避免感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。
  3.為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功,可以保留部分連接反應(yīng)液,以重新轉(zhuǎn)化,將損失降到很低的程度。

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