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化學感受態(tài)細胞的規(guī)范操作方法

2020-12-4  閱讀(1437)

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   化學感受態(tài)細胞是常規(guī)克隆和亞克隆實驗應用較為合適的解決方案。經氯化鈣處理,促進質粒DNA黏附于感受態(tài)細胞膜上。將感受態(tài)細胞通過水浴熱激,使細胞膜孔打開,從而質粒可以進入。
  操作方法:(以下操作均按無菌條件的標準進行)
  1、取感受態(tài)細胞置于冰浴中,如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中,置于冰浴中。一次轉化感受態(tài)細胞的建議用量為50-100μl,可以根據(jù)實際情況分裝使用。應注意所用DNA體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一。
  以下實驗以100μl感受態(tài)細胞為例。
  2、向感受態(tài)細胞懸液中加入目的DNA(50μl的感受態(tài)細胞能夠被1ng超螺旋質粒DNA所飽和),輕輕旋轉離心管以混勻內容物,在冰浴中靜置30分鐘。
  3、將離心管置于42℃水浴中放置90秒,然后快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻2-3分鐘,該過程不要搖動離心管。
  4、向每個離心管中加入500μl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基(不含抗生素),混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45分鐘(150轉/分鐘),目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達,使菌體復蘇。
  5、將離心管內容物混勻,吸取100μl已轉化的感受態(tài)細胞加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上,用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收,倒置平板,37℃培養(yǎng)12-16小時。
  注:涂布用量可根據(jù)具體實驗來調整。如轉化的DNA總量較多,可取更少量轉化產物涂布平板;反之,如轉化的DNA總量較少,可取200-300μl轉化產物涂布平板。如果預計的克隆較少,可通過離心(4,000rpm,2分鐘)后吸除部分培養(yǎng)液,懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。(涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的轉化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板)
  注意事項:
  1.進行轉化操作時,應根據(jù)相應溫度及無菌條件的要求進行。
  2.感受態(tài)細胞應保存在-70℃,不可多次凍融和放置時間過長,以避免感受態(tài)細胞的轉化效率。
  3.為防止轉化實驗不成功,可以保留部分連接反應液,以重新轉化,將損失降到很低的程度。

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