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檢測通過親水相互作用色譜對植物基質(zhì)中的未衍生化氨基酸進(jìn)行定量分析
閱讀：972 發(fā)布時間：2020-12-21摘要：本應(yīng)用簡報介紹了一種使用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)定量分析多種未衍生化氨基酸的方法。結(jié)果顯示，即使在存在大量植物基質(zhì)（黃瓜莖葉組織萃取物）的情況下，靈敏度、線性與回收率均十分出色。使用親水相互作用色譜 (HILIC) 可分離強極性氨基酸。在 LC/MS 兼容條件下，充分利用新一代 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 固定相優(yōu)異的分離度和峰形。
前言：多種氨基酸以百萬分之一 (ppm) 和十億分之一 (ppb) 級的水平廣泛存在于植物材料中。之前的研究中發(fā)現(xiàn)1 ，使用配備低 pH 與正離子模式質(zhì)譜檢測的親水相互作用色譜 (HILIC) 模式分析未衍生化氨基酸，能夠獲得出色的分離度與靈敏度。本應(yīng)用簡報對這些條件進(jìn)一步優(yōu)化，以對植物中的氨基酸進(jìn)行定量分析。試劑與化學(xué)品所有試劑均為 HPLC 級或更高等級。超 LC/MS 級乙腈購自 J.T. Baker (Center Valley, PA, U.S.A.)。水的凈化處理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系統(tǒng) (Darmstadt, Germany) 完成。試劑級甲酸（FA，部件號 G2453-85060）來自安捷倫科技公司。甲酸銨和氨基酸標(biāo)樣購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。氨基酸在使用前于 –70 °C 下儲存。 • Agilent InfinityLab 接頭 • 色譜柱前端：Agilent InfinityLab Quick Connect 快速連接液相色譜接頭（部件號 5067-5965） • 色譜柱末端：Agilent InfinityLab Quick Turn 液相色譜接頭（部件號 5067-5966） • 安捷倫樣品瓶，螺口蓋，棕色，帶書寫簽，經(jīng)認(rèn)證，2 mL （部件號 5182-0716） • 安捷倫固定螺口蓋，帶 PTFE/紅色硅膠隔墊（部件號 5190-7024） • Eppendorf 移液器和連續(xù)分液器 • 渦旋器和多管渦旋器 (VWR, Radnor, PA, USA) • Agilent InfinityLab 溶劑瓶，棕色，1000 mL（部件號 9301-6526） • Agilent InfinityLab Stay Safe 溶劑瓶安全蓋，GL45，3 個插口，1 個放空閥（部件號 5043-1219） • 離心機 (VWR, Radnor, PA, USA) • 超聲儀 (VWR, Radnor, PA, USA)
儀器 • Agilent 1260 Infinity 二元泵 (G1312B) • Agilent 1260 Infinity 自動進(jìn)樣器 (G7129A) • Agilent 1260 Infinity 柱溫箱 (G1316A) • Agilent 1290 Infinity 液相色譜系列超低擴散工具包 (5067-5189) • Agilent MassHunter 工作站軟件 • Agilent 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) • 安捷倫噴射流電噴霧離子源
樣品前處理：將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品與水混合至規(guī)定濃度，無需進(jìn)一步樣品前處理即可直接分析。接下來，將 15N 富集的氘代內(nèi)標(biāo) (ISTD) 加入到下列每個樣品中，至終濃度為 1500 ng/mL：異亮氨酸15N1、甲硫氨酸-d8、丙氨酸-d3、甘氨酸-d2、谷氨酸15N1、天冬氨酸-d3 和賴氨酸-d8。新鮮采集黃瓜葉片并立即置于液氮中快速冷凍，制備得到黃瓜莖葉組織萃取物。使用研缽和研杵將冷凍的黃瓜莖葉組織在液氮中均質(zhì)研磨成細(xì)粉，然后儲存于 –85 °C 的冰箱中。
稱取 100 mg 冷凍的黃瓜葉片粉末到 2 mL Eppendorf 微量離心管中，加入 1 mL 0.5 M 鹽酸水溶液進(jìn)行萃取。將離心管以 8000 rpm 的轉(zhuǎn)速渦旋混合 20 分鐘，在 25 °C 水浴中超聲 20 分鐘，然后在 20000 g 下離心 20 分鐘。后，將 250 µL 萃取上清液轉(zhuǎn)移到已加入 ISTD 的液相色譜樣品瓶中，然后用 80% 乙腈水溶液稀釋至 1 mL。
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結(jié)論：將 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱的出色分離度和峰形性能與強大的 結(jié)論將 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱的出色分離度和峰形性能與強大的 Agilent 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)結(jié)合，實現(xiàn)植物組織中未衍生化氨基酸的痕量分析。結(jié)果表明，該方法即使在基質(zhì)中也具備可定量、可重現(xiàn)且穩(wěn)定的優(yōu)勢。系統(tǒng)結(jié)合，實現(xiàn)植物組織中未衍生化氨基酸的痕量分析。結(jié)果表明，該方法即使在基質(zhì)中也具備可定量、可重現(xiàn)且穩(wěn)定的優(yōu)勢。