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單克隆分離的原理及正確操作方法
閱讀：1162 發(fā)布時(shí)間：2022-5-27
單克隆分離是由單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分裂、增殖，形成具有相同遺傳性狀的細(xì)胞群體。由于來源于同一個(gè)祖先細(xì)胞，擴(kuò)增形成的細(xì)胞群還具有十分相近的形態(tài)特征和基本一致的生理、生化特性。
是建立穩(wěn)定細(xì)胞系的重要環(huán)節(jié)，因而在現(xiàn)代生物技術(shù)和醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的常用方法有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法和病毒侵染法，兩種方法都需要借助抗生素篩選，通過單細(xì)胞克隆分離最終獲得表型穩(wěn)定、遺傳特性一致的細(xì)胞群。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法是通過轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒dna導(dǎo)入細(xì)胞，其中極少部分dna會(huì)整合到基因組，通過單細(xì)胞克隆分離和抗生素篩選，獲得表達(dá)效率高、整合穩(wěn)定的細(xì)胞群，最終構(gòu)建成穩(wěn)定細(xì)胞系；而病毒侵染法則是通過將攜帶目的片段的病毒，常用的如慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，再通過單細(xì)胞克隆和抗生素篩選，獲得穩(wěn)定細(xì)胞系。
單克隆分離方法：
a、制備小鼠腹腔細(xì)胞。同“細(xì)胞融合”一節(jié)中的方法。
b、制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、15和50個(gè)細(xì)胞三種不同的稀釋度。
c、按每毫升加入5×104-1×105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。
d、每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個(gè)稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為0.5、3和10。
e、37℃、7.5%CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測(cè)抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔，取上清作抗體檢測(cè)。
f、取抗體檢測(cè)陽性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存。