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單克隆分離的方法及具體介紹
閱讀：1448 發(fā)布時間：2022-5-6
單克隆分離是建立穩(wěn)定細(xì)胞系的重要環(huán)節(jié)，因而在現(xiàn)代生物技術(shù)和醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的常用方法有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法和病毒侵染法，兩種方法都需要借助抗生素篩選，通過單細(xì)胞克隆分離獲得穩(wěn)定、遺傳特性一致的細(xì)胞群。
通過單細(xì)胞克隆分離和抗生素篩選，獲得表達(dá)效率高、整合穩(wěn)定的細(xì)胞群，最終構(gòu)建成穩(wěn)定細(xì)胞系；而病毒侵染法則是通過將攜帶目的片段的病毒，常用的如慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，再通過單細(xì)胞克隆和抗生素篩選，獲得穩(wěn)定細(xì)胞系。
目前常規(guī)的單克隆分離技術(shù)主要包括有限稀釋法、克隆環(huán)法和顯微操作法。有限稀釋法是通過將細(xì)胞懸液連續(xù)梯度稀釋，使細(xì)胞培養(yǎng)板的一個孔中僅有1個細(xì)胞，再經(jīng)過兩周左右時間增殖，形成細(xì)胞群，再經(jīng)過驗證獲得穩(wěn)定克隆；克隆環(huán)法是通過在10-15cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞接種低密度，使分散的單個細(xì)胞各自增殖成細(xì)胞群，用克隆環(huán)方式與周圍的細(xì)胞隔離開，通過胰酶消化，轉(zhuǎn)到新的孔板中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，并檢測驗證而獲得穩(wěn)定克?。伙@微操作法是借助顯微鏡，在放大的視野下挑取單細(xì)胞，再轉(zhuǎn)至培養(yǎng)孔中，逐漸擴(kuò)增獲得單克隆。
哺乳動物細(xì)胞通過分離、稀釋接種，培養(yǎng)在適宜于單細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，形成細(xì)胞克隆，運用這項技術(shù)可以制作細(xì)胞成活曲線，即在接種相同數(shù)量細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，加入不同濃度的化學(xué)藥品，或照以不同劑量的射線，觀察其對細(xì)胞的聽見害程度，由此可以在哺乳類細(xì)胞中進(jìn)行誘變試驗及分離突變細(xì)胞。
方法：
a、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞(小鼠腹腔細(xì)胞)單層。
b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45℃水浴中溫育。
c、吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘。
d、取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。
e、37℃、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天，克隆生長至2mm時，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)。
f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。